(二)酶促生物素标记cRNA探针的应用
基本方法和放射性标记cRNA探针同,所不同的是探针浓度为2.5μg/μl。显示探针反应步骤如下。
(1)用PBS冲洗粘附有切片的载片2×3min。根据情况也可用漂洗法。
(2)将载片浸入0.3%H2O2在PBS或甲醇内30min以封闭内源性过氧化物酶。
(3)PBS冲洗2×3min,用吸水纸拭干切片周围的水份,加入小鼠抗生物素血清1:100和PBS含正常羊血清(1:30),室温1h,或4℃过夜。
(4)PBS彻底冲洗。
(5)载片加生物素化抗小鼠IgG(1:100)30min室温。
(6)PBS彻底冲洗。
(7)应用ABC复合物与等量的1%牛血清白蛋白-PBS液混合孵育1h,室温。
(8)PBS彻底冲洗。
(9)将切片覆以新鲜配制的0.025%DAB溶液,0.02%H2O2,孵育3~15min。
(10)水洗,复染,脱水,透明和以甘油/PBS或DPX封固。如需要可用银染,多层ABC或PAP法加强染色效果。
三、地高辛标记cRNA探针的应用
(一)基本原理
地高辛(Digoxigenin 简写Digo-)又称异羟基洋地黄毒甙配基,这种类固醇半抗原仅限于洋地黄类植物,其抗体与其它任何固醇类似物如人体中的性激素等无交叉反应,地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成digoxigenin –11-dUTP(图20-3)。通过随机引物或缺口翻译法(多用随机引物法),将dig-11-dUTP与探针的核酸分子相连,构成Dig-配基标记的核酸探针。将这种标记的探针与组织、细胞或染色体原位核酸分子之间的同源序列在一定条件下互补杂交,然后用偶联有酶或荧光素的羊抗高地辛抗体Tab(抗原结合片段)结合物作为酶标或荧光标记,再分别用显色底物使杂交部位显色或产生荧光以达到检测目的,其反应过程见图20-3。
图20-3 地高辛标记的探针检测酶联免疫反应
常用的免疫酶学检测方法有两类:一是Dig –HRP(辣根过氧化物酶)检测体系,以DAB(四氢氯化二氨基联苯胺)/H2O2为底物,结果为棕色;或以4-氯-1-萘酚/H2O2为底物,结果为蓝色。另一是Dig –AKP检测体系:以BCIP/NBT为底物,结果为蓝紫色沉淀。与免疫细胞化学方法相似,如应用酶促反应会较单一信号的标记物如荧光素具有更高的灵敏度。同样是酶促化学反应,AKP灵敏度和分辨率较HRP高约10倍左右,但HRP的优点为价廉、稳定。
应用地高辛标记的核酸探针也较稳定,据报告在-20℃贮存可达2年,随时要取用,不像放射性标记探针有半衰期所致的时间限制。但在现实应用中,仍喜欢采用新鲜的地高辛配基标记3~6个月以内的核酸探针。为节 省核酸探针的用量,凡使用过的含有探针的杂交液也可反复多次使用,特别是对于已知的重复性实验。对于细胞或组织内未知mRNA的检测,仍宜采用未使用过的探针杂交液为佳。
与放射性标记相比,地高辛标记探针具有非放射性探针的优点,对人体无害,不受半衰期限制,探针可长期保存。与生物素标记探针相比,地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰,敏感性高。由于地高辛具有灵敏度及分辨率高,反应产物颜色鲜艳,反差好,背景染色低,制备探针可较长期保存,对人体无害等优点,已日益显示出它的优越性和广泛的应用前景。它不仅可应用于原位杂交细胞化学,还可应用于Southern印迹杂交法检测特定基因组序列,进行RFLP分析用于基因诊断,菌落原位杂交,噬菌斑原位杂交,固定细胞及中期染色体原位杂交以及生物体液中,组织中病毒DNA序列的检测。这一技术还被应用于检测DNA标记物及测序,对人类染色体连锁图谱进行构建和基因图谱分析。