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cRNA探针在原位杂交组织化学中的应用
来源:医学全在线 更新:2007/12/3 字体:

 

  (二)基本操作步骤

  组织处理及预杂交等步骤与本章 中叙述的放射性同位素标记cRNA探针相同,但由于地高辛标记cRNA探针在原位杂交细胞化学中已愈来愈得到广泛的应用,我们在基本方法中仍较详细的叙述其操作过程。

  1.组织前处理在组织制片中以冷冻切片(厚10~30μm)最佳。切片贴在预先清洁,高温处理并涂以粘附剂载玻片上,先在37℃预干燥4h,然后置于37℃烤箱中过夜。经过上述处理的切片如在-20℃可保存2~3周,在-70℃可保存数月之久,有报告可保存数年之久的。但仍以新鲜制片为好。如为石蜡包埋切片,应脱蜡经梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在细胞内mRNA含量高时应用二甲苯脱蜡后仍能显示。经水洗后入37℃烤箱4h或过夜,然后进行杂交前处理。

  在烘烤及低温保存时,为防尘埃及空气中RNA酶的污染,宜用锡箔纸(foilpaper)包被,内加少许干燥剂(变色硅胶)。

  下列步骤所需玻璃器皿均需消毒,操作者需戴手套。

  (1)PBS洗2×3min。

  (2)选择少数几张切片作为“RNA酶对照片”。

  其它切片暂放于PBs 内。

  RNA酶对照片处理方法:加RNA酶(100μg/ml)在预热37℃的溶液内。放在潮湿的盛有少许2×SSC塑料盒或蒸发皿内。在每张切片上覆以过量的RNA酶溶液,在37℃孵育30min后用2×SSC冲洗,2×3min,然后与其它保存在PBS的切片一起进行下列处理。

  (3)蛋白酶K消化:将组织切片放在0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0,内含蛋白酶K1μg/ml,孵育15~20min。消化时间应根据组织的种类,厚度反复试验调整。时间过短探针不易进入,过长影响细胞或组织的形态结构。

  (4)0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min终止蛋白激酶K反应。0.25%乙酸酐(0.1mol/l 三乙醇胺配制)10min。

  (5)在4%多聚甲醛/PBS3min。

  (6)以PBs 漂洗2×3min。

  (7)浸入新鲜配制的0.25%乙酸酐(0.1mol/L三乙醇胺配制)10min,以封闭非特异性结合部位。

  (8)2×SSC漂洗15min。

  2.杂交以含cRNA探针(0.5ng/ml)的杂交液,按每张切片10~2μl的量覆盖切片。地高辛配基标记的cRNA核酸探针保存浓度为2.5ng/ml,用前稀释备用。覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜,置于盛有少量2×SSC温盒内在42℃,16~18h或过夜。

  3.显示

  (1)用缓冲液1冲洗杂交后的载片2×3min。

  (2)在缓冲液1中10min,室温以封闭非特异性结合部位。

  (3)拭干切片周围的载片,注意保持切片湿润。加数滴抗地高辛抗血清(工作浓度1:500,以缓冲液1稀释),孵育2h,室温。

  (4)缓冲液1漂洗3×3min。

  (5)浸入缓冲液210min室温。

  (6)浸入底物中孵育10~30min(或更长时间,视需要而定),底物内含显色BCIP/NBT,室温。最好用锡箔纸包裹反应盒,使显色在黑暗中进行。定期取出切片在显微镜下检测反应强度。根据反应强度决定延长或终止反应。反应颜色为紫蓝色。

  (7)将切片浸入缓冲液3以终止反应。

  (8)复染,可用1%伊红、1%苏木精、1%亮绿或5%的焦宁(又称派咯宁丫)(pyronin 丫)10~30s。

  (9)流水洗5~10min,直至水无色为止。

  (10)在切片未干前,以PBS/甘油封固切片,如要永久保存,可以用DPX在盖片四周封固。为去除水份,在封固前可进行梯度酒精脱水,透明,DPX封固,但每步时间仅需几秒钟,时间过长易致褪色。

  几点说明

  ①缓冲液1,2,3配制法见附录。缓冲液1中BSA用量大,价贵,如无法负担可略去。

  ②切片处理过程可采取漂浮法或载片染色法,载片染色适用于切片数数量较少时,可用液体覆盖于切片表面进行孵育,漂洗在烧杯内进行。如切片多,可将载片置于方形的染色缸(staining jar)内,将冲洗液加入缸内,如有振荡器在漂洗中稍加震荡更有助于减低背景染色。漂浮法适用于切片数量大量,将切片置于凹形碟内,或染色缸内。漂浮法的优点是节 约试剂用量,切片两面均可接触反应液,有利于信号的增强。

  ③在底物中孵育时间过长会产生弱强的非特异性染色,有时甚至误为阳性反应。解决方法一是设置对照片,二是对非特异性染色加以区别。非特异性染色与特异性染色的主要区别点在于后者有结构性定位,而前者系无结构性定位,常在切片边缘或细胞密集处呈现较强的颜色反应。

  ④在组织前处理中应严格注意控制RNA酶的污染,包括戴手套、器皿消毒等。另外,和免疫细胞化学一样,自始至终应保持切片的湿润,勿令其干燥。

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