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免疫细胞化学在细菌学中的应用
来源:医学全在线 更新:2007/12/3 字体:

 

  八、其他细菌的快速检查方法

  对军团杆菌、布氏杆菌、土拉杆菌、产气夹膜杆菌等的快速诊断,效果良好。

  九、钩端螺旋体的检查法

  (1)根据当地钩端螺旋体的型别制备多价抗体、标记FITC制成荧光抗体。

  (2)检查方法:

  ①血液标本的检查:取发热期的病人或发病动物的血液约2ml,制取血浆,并加入钾明矾(0.058g/ml),振荡混匀后置室温10~15min,然后中速离心沉淀,取沉渣涂片,晾干,95%酒精固定。免疫荧光染色,镜检。

  ②尿液标本检查:取病人或动物尿液约2~3ml,高速离心,取沉渣涂片,无水乙醇固定,免疫荧光染色,镜检。

  ③脏器标本的检查:取发病动物的肾脏皮质部分,以刀片切出整齐断面,滤纸吸去血液,再以洁净载玻片压印制片,晾干后以丙酮在4℃固定。经10%甲醛固定的组织可作冰冻切片,依丙酮-乙醇-甲醇的次序固定,荧光抗体染色前以3%表面活性剂如Tween20处理切片,据称,这样可使荧光强度增加4倍。

  ④培养液检查:同尿处理。

  ⑤特异性抗体的检查:用适当血清型的钩端螺旋体作抗原,用间接法检查病人血清中的特异性抗体,可用于流行病学调查和临床追溯诊断。此检查适用于人类和家畜等。

  本法诊断钩端螺旋体,一般只具有属的特异性,鉴定抗体则可能达到型的特异性。

  十、梅毒螺旋体的检查法

  免疫荧光细胞化学应用于梅毒血清学诊断有很多文献报道。70年代应用PAP法又将敏感性提高了许多倍,此法已作为梅毒诊断的常规方法。用间接免疫荧光法可PAP法,取已知梅毒螺旋体作抗原,检查病人血清中的特异性抗体。

  (一)抗原制备

  以标准株(如Nicol株)梅毒螺旋体感染家睾丸,约1周后待睾丸产生明显炎症,剖腹将睾丸摘除,仔细清除精索、附睾和包膜,然后以灭菌器械将其剪成薄片,置于烧瓶内,加入20ml生理盐水,振荡30min,使螺旋体逸出,2000r/min离心10min以除去组织碎块和血细胞,将上清高速离心(10,000r/min)30min,去上清,沉淀以5ml生理盐水洗涤,再高速离心,洗涤,反复3次以上,以尽可能除去组织成分和家兔球蛋白,最后以pH7.2PBS(内含0.01%硫柳汞或数滴福尔马林以防腐)将沉淀制成敏感毫升约含10,000,000螺旋体的悬液,置4℃保存备用。有效期约半年。医.学.全.在.线网站www.lindalemus.com

  (二)荧光抗体

  用抗人IgG和IgM荧光抗体。为诊断新生儿先天性梅毒,必须用抗人IgM荧光抗体。

  所有稀释用PBS 0.1mol/L Na2HPO4-KH2PO4,0.15mol/l NaCl Ph7.2含1%Tween-80。

  (三)间接免疫荧光染色方法(FIA试验)

  1.定性检查  先将待检血清灭活。在载玻片上以白金耳取抗原液涂片,每片涂4个点,在室温中晾干,丙酮固定10min。各点分别加-1:50稀释待检血清;②-1:200稀释阳性血清;③-1:50稀释阴性血清;④-PBS。放入湿盒,在37或室温中放置20min,用PBS振荡洗涤10min,再加适当稀释的抗人IgG和IgM荧光抗体,再同上条件下放置20min,水洗,封裱,镜检。结果如①、②荧光阳性,③、④阴性,待检血清即判断为阳性。阳性时梅毒螺旋体呈明亮的黄绿色荧光,亦有人将待检血清稀释1:200作定性检查,这样可排除低稀释时正常人可出现的假阳性反应,此法又称FTA-200试验。

  2.滴度测定  如定性检查阳性,则被检血清应进一步稀释成1:100,1:200,1:400,1:800,1:1600……以定出染色滴度,滴度疑点以螺旋体发“++”荧光为标准。

  (四)荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验(Fluorescent treponemal antibody – absorption Test 简称FTA-ABS)

  FTA-200试验敏感性较差,有时查不出潜伏期和晚期梅毒。FTA-ABC试验不但敏感性高,而且特异性更好。方法是将非致病性螺旋体Reiter株的培养液于121℃高压加热10min,然后高速离心、沉淀,取其上清浸液作为吸附剂,并用以稀释病人血清(1:5),然后如上法(FTA试验)进行染色检查。

  FTA-ABC所用的反复洗涤过的纯梅毒螺旋体抗原,推荐置1.0%清蛋白、0.0375mol/l 葡萄糖、0.01mol/L二氯化镁和0.85%氯化钠溶液(用0.1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.8配制)中冰冻干燥保存,其中清蛋白起保护剂的作用,葡萄糖可增加折光率,二氯化镁维持螺旋体的形态学,缓冲液稳定pH。

  (五)梅毒螺旋体的直接检查法

  取梅毒局部硬结渗出液涂片,用直接法或间接法免疫细胞化学染色,更容易发现隐藏在细胞碎片之间的螺旋体。免疫荧光检出效果和暗视野检一样敏感。如用RB200标记牛清蛋白作初染色,图像更为清晰。

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