(三)神经细胞的类型
依形态学分类:Dogiel建议将肠道神经元分为三种类型:
1、I型具有许多短的、不规则的树突和一根细而长的轴突。
2、II型有一个短而局限于节 内轴突和许多长的延伸到神经节 外的树突。
3、III型具有中等长短的树突,终止于同一或邻近的神经节 。
Dogiel认为I型属运动神经元,II型属感觉神经元。肠道神经节 内存在dogiel I型和II型细胞,还存在其它的中间型细胞,如在猫的粘膜下神经丛中,单极和双极的神经细胞占83%,多极的神经细胞占17%。这说明肠道神经细胞形态的多样性。然而对于其形态与功能的相关性,是否I型与II型分别代表感觉及运动神经元,多数学者持怀疑态度。
依所含化学物质分类:可分为含乙酰胆碱神经细胞、含胺神经细胞、含嘌呤核苷酸神经细胞和含多肽神经细胞。免疫细胞化学技术是显示含多肽神经细胞的有力工具。现已知在消化管壁内神经丛内含有血管活性肠肽、生长抑素、物质P和脑啡肽等多肽。用双重免疫染色法可证明一种以上的多肽共存于神经细胞内。
二、消化道全层铺片技术
用消化道切片结合免疫细胞化学染色固然能显示壁内神经丛的神经细胞及纤维。但由于壁内神经丛为扁平的网状结构,欲窥其全貌,则以消化道全层铺片技术进行免疫细胞化学染色效果最佳。消化道全层铺片在英文文献中通常称为whole mount stretch preparation,即整装撕片。即根据消化管壁内神经丛的结构特点,分纵层肌、环层肌、粘膜下层等分层撕开铺片,以暴露不同的壁内神经丛。以肠道为例,简述消化道的分层铺片技术。
动物麻醉后,用Zamboin’s液行主动脉灌注固定,剖腹取任何一段肠管放入上述固定液中4℃下3h,然后移至4%多聚甲醛液固定3h,再移至20%蔗糖4℃过夜,于次日行全层铺片。选择一大小适宜的吸管或玻棒穿入肠管,使其被动扩张,然后用钟表镊在肠系膜附着处沿肠管纵轴划痕,用镊尖沿划痕轻轻剥离分离纵肌层,将剥离的纵肌层放在载玻片上(浆膜面向下)。在解剖显微镜下,用镊尖轻挑去附于神经丛上的环层肌,即得纵、环肌之间的肌间神经丛。再将肠管的粘膜面向外翻套在吸管或玻棒上,用镊子或手术刀反复刮去表面的上皮层,即可获固有层表面的粘膜丛,重刮时刮去表面的粘膜层,即可暴露粘膜下层的粘膜下神经丛。
撕片放入0.1mmol/L的PBS溶液中,等待进行免疫染色。其步骤与切片染色同,只是由于撕片较厚,为增强抗体的穿透性,常于染色前在系列酒精中反复脱水后,再进行免疫染色。一般撕片进行免疫染色地漂浮法为佳,可增加壁内神经丛与抗血清的接触。如撕片数量少,为节约抗血清也可用载片法,此时载玻片上需涂抹一层粘附剂如铬矾明胶或多聚赖氨酸,以免撕片在染色过程中脱落。