（2)免疫应用的荧光染料及染色：免疫应用中的荧光染料主要有FITC（488nm)、TRITC（515nm)、PE（藻红蛋白，575nm)及其组合。在进行多种标记时特别要注意结合抗体的每种色素都不干扰抗体反应的特异性，也不相互干扰。

　　免疫荧光染色有直接法和间接法二类：

　　①直接染色法

　　1)取约10⁶的细胞置于尖底离心管内，管内液体要少些。加荧光标记抗体，在4℃温度下静置15～30min。若作双标记染色也可直接加入。

　　2)用冷的10%的小牛血清、0.1%的叠氮钠溶液，1/15mol/L的PBS（pH4.4)离心清洗细胞2次。1000rpm离心5min或4000rpm离心1min。

　　3)加入适量缓冲液待测。

　　②间接染色法：

　　1)取10⁶细胞加特异的第一抗体，4^℃温度下静置15～30min。

　　2)加缓冲液离心清洗2次后，吸尽残留液体，弹散沉淀，加入荧光标记的第二抗体，4^℃静置30　min。

　　3)缓冲液离心清洗2次后加入适量缓冲液待测。为减少无关因素干扰，操作尽量在水浴中进行。

　　染色中应注意的事项：①细胞标本在整个过程中要尽量保持新鲜，采用有效措施防止表面抗原消失和细胞死亡；②荧光标记物用前应用滤膜或高速离心去除颗粒或沉渣以减少非特异性干扰；③细胞标本染色前应除死细胞；④为提高灵敏度可用三步间接染色法。

　　（3)免疫荧光标本的特殊处理：

　　①死细胞及碎片去除：样品中不可避免地存在着死细胞及碎片，影响分析结果。对于血细胞可用FCM通过0^。散射的差异不经染色而将死细胞分出弃除；对于培养细胞，由于其大小分布不均，可在样品内加少量PI染色后将死细胞去掉。一般情况下即可用仪器直接去除碎片，也可用血清沉降法去除大碎片，用离法去除小碎片。

　　②标本的保存和固定：实验中大多数样品在染色或分析前需要保存一定的时间，有时甚至需要进行固定。

　　未染色的新鲜标本贮存方法如下：10%二甲基亚砜，90%小牛血清，5×10^6～1×10⁷细胞在-70^℃过夜，然后置液氮中可长期保存。

　　免疫染色未经固定的标本在4^℃可保存48h。若需存放时间较长、或标本具有传染性，应该用固定剂固定。常用的固定剂配方是：1%～4%的多聚甲醛和PBS或0.8%的生理盐水配成p H7.2的固定液；或用0.37%～1.5%甲醛和PBS配成p H7.4的固定液。固定方法是：将经免疫荧光染色的细胞离心沉淀，再加入固定液混匀，放在4^℃温度保存。一般来说，经固定处理的标本保存1周至2个月，多数样品的阳性细胞群体比例及荧光强度增色能保持在正常范围之内。

　　（4)主要检测的免疫指标：

　　①细胞毒试验：细胞毒是机体的一种免疫监督机制，细胞毒实验是一项重要的免疫指标。例如天然杀伤细胞NK（Natural killer)是一种引起免疫媒介的效应物，在抗肿瘤及感染因子的免疫监督系统中起着重要作用。研究表明，对NK细胞的测量可以做为免疫治疗监测的重要参数和有效的预后征状的指标。所使用的荧光探针为CFDA（Caboxy-fluorescein diacetate)。

　　②吞噬功能实验：单核吞噬细胞系统是机体的主要防御系统之一。FCM可以快速、定量地检查吞噬细胞的吞噬能力和速度。

　　③I型变变态反应的IgE受体细胞、IgE结合因子的检查。

　　④胞浆Ig及血清Ig分析，血小板表面的IgG测定，等等。

　　3．在临床方面的应用FCM在临床诊断、疗效评价和预后预测等方面都发挥了一定的作用。工作做得较多的主要在肿瘤学、血液病学等。这些都和FCM在荧光细胞化学中的直接应用有关。医.学 全,在.线,提供www.med126.com

　　（1)癌前病变的检测和预后评价：有效地发现癌前病变而给予阻断治疗，无疑是肿瘤防治的重要环节　。FCM的探测对象主要是癌前细胞，即那些处于正常细胞向癌细胞转化的量变阶段、尚未达到质变的细胞。研究表明，除心肌、肝组织及精子细胞外，人类正常的体细胞都具有恒定的DNA二倍体含量，而那些癌前细胞和癌细胞则在其发生发展过程中伴有DNA含量变化异常。另在资料表明：癌前病变向癌变的转化发生率与细胞的不典型增生程度有关，而细胞的不典型增生程度又与DNA含量的异常改变呈平行关系。利用FCM可以定量地测出癌前细胞的DNA含量并根据DNA分布直方图直观地反映出细胞的周期分布状态，从而了解到癌前细胞增殖能力变化的动态过程，这样便可以获得一些从组织形态学中难以得到的信息。

　　表10-1 是以胃粘膜为例比较正常细胞和胃癌细胞在DNA含量及细胞周期分布方面的差异。

表10-1　正常与胃癌的胃粘膜细胞DNA含量方面的差异

　　从表中看出差异是显著的。我国一些学者也提出有关FCM诊断癌肿细胞的细胞标准，并已付之临床应用。

　　目前，对于癌症病人预后评估的主要依据是病理组织学分级和临床分期等指标，不少人已认识到用FCM来检测DNA是对肿瘤预后评价的一个较为客观有效的指标。总的倾向是：异倍体的出现是恶性肿瘤的一个标志；异倍体肿瘤的恶性程度高、复发率高、转移率高及死亡率高；二倍体及近二倍体肿瘤预后较好。

　　在临床血液学方面的应用目前也以血液系统的肿瘤诊断、分型和预后关系等方面的应用为主；其主要技术途径也是基于对DNA倍体分析和细胞增殖周期的分析。限于篇幅不再多叙。有关的技术细节　将在下节　以FCM在外周血白细胞的免疫组织化学分析方面的应用为例详加介绍。

　　（2)DNA指数：由于DNA的非整倍体细胞是肿瘤的特异性标志已经得到肿瘤学界的公认，在些学者提出建议采用流式细胞术DNA分级指数（Flow cytometry DNA Crading Index, 简称DNA指数或DI)表示DNA含量的异常程度。根据1984年国际分析细胞学会名词审定委员会的规定：

　　一般样品应采用同种或同个体的正常细胞为标准二倍体细胞。在血液学研究中通常以正常人外周血淋巴细胞作为标准二倍体细胞。需要指出的是，在报告DNA的测定结果时必需包括G₀/G₁峰的变异和系数，即C.V值，若有多个DNA干系则要给出各个G₀/G₁峰的C.V值。用于肿瘤临床诊断的总体依据是：a.正常二倍体的DI=1.0，判断为阴性；b.出现二个或多个可以分辨的G₀/G₁峰则可判断为阳性；c.虽无明显的G₀/G₁峰的分化现象，但峰的C.V值较大，则可根据DI数个及其它有鉴别意义的征状给出参考性的诊断。

　　以上我们主要从FCM在生物医学工程学领域应用的基本原理和技术途径介绍了和组织化学有关的内容，至于一些技术细节　则在下节　做较为详细的说明。

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