常用的标记方法有：
（一)氯胺T法
氯胺T法标记效率高、重复性好、试剂便宜易得，是目前使用最多的碘标记方法。
1．原理氯氨—T（Chloramine--T)是一种温和的氧化剂，在水溶液中产生次氯酸，可使碘阴离子氧化成碘分子。这活性碘可取代肽链上酪氨酸苯环上羟基位的一个或两个氢，使之成为含有放射性碘化酪氨酸的多肽链。
2．方法以125I—AVP的制备为例。
（1)碘化反应：AVP5μg+0.5mol/l PB50μl（pH7.5)+1251800μCi,混合后，加入新配置的Ch—t 30μg/15μl(0.05mol/l PB, pH7.5)。迅速振荡混匀，室温下反应40s。
（2)终止碘化反应：加入还原剂偏重亚硫酸钠40μg/20μl(0.05mol/l PB, pH7.5),以终止碘化反应。
（3)Bio—Gel P2层析纯化：将碘化反应混合液注入Bio—Gel P2柱，用0.1n HAC溶液洗脱，分部收集，每2min收集一管，共收集60管。
（4)放射性测量：测定各收集管的放射性，出现两个峰，第一峰为125I—AVP，第二峰为游离碘盐峰。第一个峰中计算最高的几管，留下备用。
为了解标记抗原的质量，每次碘标记后应计算出碘的利用率，标记上多少放射性碘，以及每微克抗原结合上多少放射性碘。
（5)标记抗原的贮存：经纯化与检查后的标记物、加入1/8体积的异丙醇，分成若干小份，置于铅罐中，在-20℃以下的冰箱中贮存备用，应避免反复冻融。标记抗原在贮存中是不稳定的，这是因为：一是脱碘，标记的碘从原来位置上脱落，变成游离碘；二是蛋白损伤、变性，成为聚合大分子或断键成小分子碎片。由于上述原因，使B/F明显降低，标准曲线斜率变小，以致不能使用，故需分离纯化，其方法是用Sephadex G100长柱（40～80cm )过柱，洗脱后出现3个峰。第1个峰分子量大，是蛋白变性的聚合的大分子，尚保留部分抗原决定簇，免疫活性弱；第2个峰是纯抗原的蛋白峰，免疫活性好；第3个峰是游离125I或小分子碎片，不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰，免疫活性好；第3个峰是游离125I或小分子碎片，不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰，其性能类似于新鲜标记的抗原。分离纯化的方法解决了标记抗原的贮存、长期使用问题，特别对来之不易的抗原更显得重要。
2．注意事项
（1)放射性碘源的选用：无载体的131I或125I均可用于碘化标记，但应尽量选用新鲜的、比放射强度高的、含还原剂量少的放射性碘源。碘源的比放射强度最好≥50～100mCi/ml，至少也要>30mCi/ml，否则加入碘源的容量要增加，随着带入碘源中含有的还原剂（为放射性碘源运输保存所需加入)量也增加，这将会显著降低碘利用率及标记蛋白比放射强度。放置较久和放射性碘源，一方面因衰变致比放射强度降低，另一方面因水的辐射化学产物增多（主要是131I源)，都会降低标记时的碘利用率。放射性碘源含还原剂（如Na2S2O5等)量多时，会抵消氯胺T的作用，降低碘利用率，甚至导致标记完全失败。放射性碘源要用无载体的，标记所用全部用具和试剂必须不含碘；只要有极少量的碘的污染，非放射性碘就会稀释放射性碘，使放射性碘利用率显著降低。为了便于放射性防护和除污染，以及减少射线对蛋白质分子的损伤，标记投入的放射碘量不宜过大，一般以<5mCi为宜。
（2)放射性碘与多肽、蛋白质用量的比例：这比例对标记结果的影响很大。如上述原因，一般标记时放射性投入量不宜过多，示踪实验室中常规每次只用1～2mCi，因而放射性碘与多肽、蛋白质用量的比值主要靠标记时投入的多肽、蛋白质用量来控制。当投入的放射碘量一定时，多肽、蛋白质用量多（即I/多肽、蛋白质比值低)，能获得高碘利用率，但所得标记蛋白比放射强度低；相反多肽、蛋白质用量少（即I/多肽、蛋白质比值高)，则碘利用率降低，但所得标记多肽、蛋白比放射性随此比值变化都有较大的变动；而当此比值<1后，则碘利用率再下降的幅率较小，标记多肽、蛋白比放射性也不会再增加多少。
（3)氯胺T与偏重亚硫酸钠的用量及碘化反应时间：氧化碘化标记法中，会导致失活的最主要原因是氧化还原。氯胺T是氧化剂，早期用氯胺T法作碘化标记时氯胺T用量都比较大，或碘化反应时间较长，结果导致蛋白质结构和活性的严重损伤。氯胺T用量大，或长时间进行碘化反应，结果并不能使碘利用率和标记多肽、蛋白质比放射强度提高多少，反而使标记多肽、蛋白活性下降。当用不含还原剂或还原剂很少的放射性碘源时，试以各种蛋白质（包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰岛素等)作微量标记，当氯胺T用量为20μg/0.1ml反应液、0～20。C反应20s，碘利用率都已接近或达到最大峰，再加大氯胺T用量和延长反应时间是没有必要的。随放射性碘源中还原剂增多，氯胺T用量也应增加，以达到预期的碘利用率，但决不应盲目加大氯胺T用量和延长碘化反应时间（通常反应时间不要超过1min)，否则会导致标记多肽、蛋白质严重失活，不能用于实验。当然，减少氯胺T用量要在了解放射性碘源还原剂含量的基础上，否则碘源中还原剂量较多，双盲目减少氯胺T用量，就会使标记失败。一般用125I标记时，氯胺T用量要适当加大。加入氯胺T后必须迅速混匀，以防标记不均匀。氯胺T与偏重亚硫酸钠溶液要新配制的。
氯胺T用量减少了，Na2S2O5用量也就可以随之减少。为保证按时终止碘化反应，实验时加入Na2S2O5一般都是过量的。氯胺T用量大时，加入Na2S2O5的剩余量也就会随之增加，这就可能加重某些对还原剂敏感的蛋白质或多肽生物活性的损伤。为此，Na2S2O5用量也不应过多。只要药品没有变质、试剂是新配的，以重量计算Na2S2O5加入量与氯胺T相同就足以保证终止碘化反应（按反应克分子浓度计算，Na2S2O5/氯胺T重量比约0.4)，不要盲目加大用量，并应迅速将标记多肽、蛋白质从反应液中分离出来，以尽量减少多肽、蛋白质活性的损伤。
某些蛋白质或多肽对氯胺T较敏感，还可进一步减少氯胺T用量、缩短碘化反应时间、降低反应温度，以保护蛋白质的活性。这对一些较容易丧失活性蛋白质或多肽的碘标记十分重要。
