二、胶体金标记蛋白A技术（Protein A-gold technique, PAg法)
在电镜水平应用较为广泛，因该法具有特异性中、灵敏度高、方法简便和背景染色淡等优点。蛋白A的免疫特异性在第五章 已作了介绍，PAg复合物制备方法简便，作为第二抗体，无种属特异性，可以免去不同种属动物要制备不同的特异性免疫球蛋白。PAg 复合物与包埋剂和细胞成分都极少发生非特异性的交互作用，蛋白A和金粒间非共价的结合特性既不影响蛋白A的活性，又能保持高度的稳定性，PAg复合物分子最小易于穿透组织。
1．蛋白A—金（PAg)复合物的制备（Slot 和Geuze,1981)
（1)胶体金液的制备，应用枸椽酸三钠还原法（见第五章 )。
（2)待标记蛋白质和金溶液的准备，同前。注意点是用0.2mol/l K2CO3将金溶液pH调至5.9～6.2之间。
（3)确定胶体金与蛋白A的结合用量比例。取一系列盛有0.1ml胶体金液的小玻璃管，分别加入不同量的蛋白A，5min后，再各加0.25ml 10%的NaCl。如加入的蛋白A浓度不够，不能稳住金粒，在电解质NaCl的影响下，金粒聚合沉淀，溶液由红变蓝。选择能防止溶液由红变蓝的最低浓度的蛋白A的量作为两者的结合比例。以枸椽酸钠法制成的胶体金每毫升约需要5μg蛋白A来结合，方能保证其稳定性。医学全在.线提供
（4)胶体金与蛋白A的结合和纯化，依上法测得所需的比例超过10%，即每30ml胶体中加入2mg蛋白A，5min后，加入0.3ml PEG作为稳定剂，然后以15000r/min离心45min（不同方法制备的金离心速度不同)，略带红色的松散的复合物沉淀即为PAg复合物。小心弃去上清液，加入PBS冲洗，如上，松散的PAg复合物置于PBS溶液中，按0.2mg/ml的比例加入聚乙二醇作为稳定剂，保存于硅化的玻璃器皿中备用，也有主张将上述PAg复合物放入3～6ml 5%甘油—0.05%聚乙二醇—0.02%叠氮钠混合液中，再离心，弃去无色上清液后，收取管底部浓缩纯化的PAg复合物置4℃保存。
据文献报告，此PAg复合物的原液在4℃可保存达一年之久。
2．电镜水平的PAg染色法 PAg法在电镜技术的应用原则是二步标记法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要区别于一般胶体金免疫染色在：①须1%卵白蛋白—PBs （pH7.4)或1%卵白蛋白—0.05mol/l Tris缓冲液（pH7.4)来封闭非特异性的结合部位，而不是采用羊或其它的动物的正常抗血清，因为PAg复合物能够与正常血清组中的Ig结合，从而给出假阳性结果；②在应用第一抗血清孵育和PBS冲洗后作第二抗血清即PAg复合物孵育前的准备时，应用的PBS或TBS的pH应变更为pH7.4。在变更这两步后，其它可参照本节 中包埋前、后染色法进行。也可采用下列步骤进行包埋后染色。
（1)载有超薄片的镍网或金网浮于1%卵白蛋白—PBS液滴上，室温约5min。
（2)载网不冲洗，直接移至第一抗血清液滴上，在室温孵育2h或4℃18～24h。
（3)PBS冲洗3min×2次。
（4)将PAg原液稀释10～20倍，载网浮于该液滴上，室温孵育1h。
（5)PBS冲洗5min×2次。
（6)5%醋酸铀水溶液染色，水洗。
（7)枸椽柄铅染色。
（8)电镜观察。
