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 医学全在线 > 理论教学 > 基础学科 > 免疫细胞与核酸分子杂交 > 正文
电子显微镜免疫细胞化学技术(免疫电镜技术技术)概述
来源:医学全在线 更新:2007/12/3 字体:

  免疫细胞化学技术为在细胞水平上研究免疫反应做出了贡献,但由于光学分辨率的限制,不可能从细胞超微结构水平观察和研究免疫反应。因此,Singer于1959年首先提出用电子密度较高的物质铁蛋白(ferritin)标记抗体的方法,为在细胞超微结构水平研究抗原抗体反应提供了可能。在此基础上,相继发展了杂交抗体技术、铁蛋白抗铁蛋白复合物技术、蛋白A-铁蛋白标记技术、免疫酶技术及胶体金技术等。电子显微镜免疫细胞化学技术(以下简称免疫电镜技术技术)区别于免疫细胞化学和常规电镜技术主要在以下几方面:

  一、组织固定与取材

  在这方面的要求是即要保存良好的细胞超微结构,又要注意保持组织的抗原性。因此,选用固定剂不宜过强。常用的免疫电镜固定剂有多聚甲醛—戊二醛混合液和过碘酸-赖氨酸—多聚甲醛液(Periodate—Lysine –Paraformaldehyde简称PLP液)。也有采用Bouin氏液、Zamboni氏液或4%多聚甲醛液(其配制法见附录)。国外不少文献推荐应用PLP液于免疫电镜技术,认为该固定液对含糖类丰富的组织固定效果特佳,因为组织抗原绝大多数由蛋白质和糖两部分组成,抗原决定簇位于蛋白部分,有选择性地使糖类固定,就可使抗原性稳定。PLP液中过碘酸能氧化糖类,使其产生醛基,再经赖氨酸作用,使新形成的醛基分子间和分子内相互连接,稳定组织抗原。但赖氨酸价格较贵,不如多聚甲醛戊二醛固定液经济、简便、效果佳。在取材方面,免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。

  二、免疫染色

  分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三种。

  1.包埋前染色  即先行免疫染色,在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出,修整成小块,按常规电镜方法处理,经锇酸固定、脱水、包埋。如果特异性免疫反应的范围太小,为了准确定位,可作第二次包埋,即第一次包埋时将组织置于两层thermanox塑料片之间,中夹环氧树脂如夹心面包式,进行高温聚合,然后在解剖显微镜下取出需要部位作第二次包埋。包埋前染色的组织,以中层较为理想。表层因受机械修整,结构往往保存不好,深层因抗体不能透入,免疫反应弱或无。在作超薄切片前应先切半薄切片,寻出免疫反应阳性部位。根据作者经验,半薄切片可在相差显微镜下不染色进行观察(指PAP染色法),免疫反应部位呈黑点状。在HE或甲苯胺蓝染色的半薄切片上,免疫反应部位呈棕黄色。据此定位作超薄切片,可大大提高阳性反应检出率。为避免电镜、铀染色反应与免疫反应之间的混淆,可取相连续的起薄切片,分别以两个铜网捞取,其中之一进行染色观察,另一以铀单染色或不染色进行对照观察。

  包埋前染色法的优点是:①切片染色前不经过锇酸后固定、脱水及树脂包埋等过程,抗原未被破坏,易于获得良好的免疫反应。②可在免疫反应阳性部位定位作超薄切片,提高电镜下的检出率。特别适用于含抗原量较少的组织,但由于经过一系列的免疫染色步骤,常出现一定的超微结构损伤。

  2.包埋后染色  组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片后,再进行免疫组化染色。由于是以贴在网上的超薄切片进行免疫染色,故又名之载网染色(on grid staining)。必须指出的是:①后固定中是否应用四氧化锇存在不同意见,作者经验一般以不用四氧化锇为佳,或尽量缩短在四氧化锇中停留的时间。有作者认为,从理论上讲,四氧化锇具有保存抗原的作用,但实践证明应用四氧化锇可使抗原活性明显减低。②在载网染色过程中,铜网易与化学物质产生反应,故需选用镍网或金网。③在免疫组化处理的全过程中,应注意保持网面的湿润,网面干燥会影响抗体活性。本法的优点是超微结构保存较好,方法简便,阳性结构有高度的可重复性,还能在同一张切片上进行多重免疫染色。但抗原活性在电镜生物样品处理过程中可能减弱甚至丧失;环氧树脂中的环氧基,在聚合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质;包埋在环氧树脂中的环氧基,在聚合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质;包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。因此,免疫组化工作者曾试图以不同的方法如饱和苯溶液,无水酒精中NaOH饱和溶液或乙氧化钠溶液等以减少或去除包埋剂,取得不同程度的效果。现普遍采用的是在进行免疫染色前,以H2O2液蚀刻数分钟,以去锇和增强树脂的穿透性。医学全在线网站www.med126.com

  3.超薄冰冻切片  按照Tokuyasu建立的方法,将组织置于2.3mol/L蔗糖液中,以液氮速冻,在冰冻超薄切片机上切片,切片厚度可略厚于常规树脂切片。冰冻超薄切片由于不需经固定、脱水、包埋等步骤,直接进行免疫染色,所以抗原性保存较好,兼有包埋前和包埋后染色的优点。

  三、包埋

  (一)树脂包埋

  国内现普遍采用的是环氧树脂包埋法,可直接脱水后包埋,也可将小片组织或半薄切片贴在载片上,将充满环氧树脂的明胶囊倒置于切片上聚合、硬化,进行原位包埋。

  (二)低温包埋

  常规树脂包埋由于需高温聚合等处理程序,组织抗原性可能全部或部分丢失。因此,在免疫电镜技术方面,国外不少实验室已开始采用低温技术如低温包埋和冰冻超薄切片等,后者需配备冰冻超薄切片机,且技术难度较大,不如低温包埋法易推广。低温包埋剂的研究开始于60年代,80年代免疫细胞化学技术在电镜水平上的广泛的应用,为低温包埋剂的实验研究开辟了广阔的领域。国内已有较多的应用报道,国内一些实验室已开始摸索。作为低温包埋剂的多为乙烯系化合物如乙二醇甲基丙烯酸酯(Glycolmethacrylate,GMA),Lowicryls, LR White和Lr Gold等,目前国外生产厂家有Polysciences INC , Reichert—Jung 和LKB等系列产品。现将常用的几种低温包埋剂及其应用简单介绍如下:

  1.Lowicryls 是丙烯酸盐(acrylate) 和甲基丙烯酸盐(methacrylate)化学物质,包括K4M、HM20、K11M、KM23等系列产品(Polysciences INC),其特点是能在低温下保持低粘度(K4M:--35℃;HM20:-70℃;K11M、HM23:-60℃~-80℃)和具有在光照射(紫外光,波长360nm)下聚合的能力,它的光聚合作用与温度无度。其中K4M和K11M具有亲水性,特别适合于免疫细胞化学的应用,因它能较好地保持组织结构和抗原性,减少背景染色。HM20和HM23具疏水性,能产生高反差图像,适用于扫描、透射电镜和暗视野观察切片的制作。所有这些种类的低温包埋剂都适用于冰冻置换技术。K4M的应用和报道较多,现侧重介绍如下:

  (1)包埋剂的配制:商品提供的Lowicrys包埋剂由三个部分组成:单体(Monomer),交联剂(Crosslinker)和引发剂(Initator)。调整单体和交联剂的比例,增加交联剂的量,组织块的硬度增加。中等硬度的组织块,其配制比例如下:

  K4M:单体   17.30g

  交联剂  2.70g

  引发剂  0.10g

  K11M:单体  19.00g

  交联剂  1.00g

  引发剂  0.10g

  作者的经验,可用微量注射器加针头抽取后,注入棕色的玻璃容器避光,用玻棒轻搅3~5min或用一小管通入液氮气泡以搅拌之。勿过分搅拌,以防氧的气泡进入包埋剂中。

  (2)生物样品处理程序(Lemanski 等1985)

  ①动物麻醉取材,以多聚甲醛—赖氨酸—过碘酸钠在9℃固定2h。

  ②磷酸缓冲液含7%蔗糖,pH7.2,冲洗过夜,0℃

  ③0.1mol/L 磷酸缓冲液,pH7.2,冲洗,0℃

  ④脱水:65%乙醇,1h ,0℃

  80%乙醇,2h,-35℃

  Lowicryl K4M:80%乙醇=1:11h -35℃

  Lowicryl K4M:80%乙醇=2:11h -35℃

  100% Lowicryl K4M 1h -35℃

  100% Lowicryl K4M 过夜-35℃

  ⑤包埋:新鲜K4M置于胶囊内,将组织移入,在-30℃~-40℃以紫外线灯波长360nm 2× 15W(Ladd Research Industries Burlington VT)相距30~40cm照射24h使之聚合。如为100W灯泡,照射距离应大于85cm。聚合后的胶囊移至室温在紫外线下继续照射2~3天,可增加其硬度,便于切片。

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