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 医学全在线 > 理论教学 > 基础学科 > 免疫细胞与核酸分子杂交 > 正文
光镜免疫金银细胞化学方法
来源:医学全在线 更新:2007/12/3 字体:

  一、免疫金染色

  (一)免疫金法(IGS)

  1987年,Geoghegan等首次应用免疫金探针检测B淋巴细胞表面抗原,建立了用于光镜水平的免疫金法(Immunogold staining, IGS)。IGS的特点是染色程序简便,不要显色,就能检测细胞表面的抗原,又能检测细胞内抗原。染色时免疫金法一般要求金颗粒的直径大于20nm,并且用的浓度较高。用IGS定位细胞抗原时一般都采用间接法,下面以人肝组织HBsAg的定位为例说明IGS的步骤:

  (1)石蜡切片→脱蜡至水。

  (2)0.1%胰蛋白酶消化10min或3mon/L尿素消化30min。

  (3)用双蒸水振洗5'×2。

  (4)用0.02mol/l TBS pH8.2振洗10'×2。

  (5)1%卵蛋白(EA)封闭10min。

  (6)稀释鼠抗HBsAg单克隆抗体(用0.02mol/l TBS pH8.2 作1:100稀释),4过夜。

  (7)0.02mol/l TBS pH8.2振洗10'×2。

  (8)1%EA封闭10min。

  (9)0.02mol/l TBS pH8.2 稀释抗鼠金标抗体(1:8)37℃45min。

  (10)0.02mol/l TBS pH8.2振洗10'×2。

  (11)双蒸水振洗5'×2。

  (12)1%戊二醛,10min。

  (13)双蒸水5min 。

  (14)用苏木素衬染核1min,甘油封片。

  结果:在光镜下可见部分肝细胞浆内有金颗粒聚集呈红色,沿细胞膜分布,表明有HBsAg定位在细胞浆内。

  (二)蛋白A-金(PAG)放大法

  为了得到更明确的染色结果,在用IGS方法定位细胞抗原时可采用搭桥法,使IGS得到放大,这里介绍一种用抗A蛋白抗体作桥的PAG放大法。下面以5-羟色胺定位为例说明这一新方法。

  (1)石蜡切片→脱蜡至水。

  (2)1%胰蛋白酶消化10min或3mon/L尿素消化30min。

  (3)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5'×2。

  (4)1%EA封闭组织10min。

  (5)用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀释兔抗5-羟色胺抗体(1:1000)4℃过夜,或者37℃1h。

  (6)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5'×2。

  (7)1%EA封闭10min。

  (8)用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀释PAG(1:40),371h。

  (9)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10'×2。

  (10)1%EA封闭10min。

  (11)抗A蛋白抗体(1:100)37℃。45min。

  (12)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10'×2。

  (13)加0.05mol/l pH7.4 TBS稀释PAG(1:40),37℃45min。

  (14)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10'×2。

  (15)双蒸水振洗5min。

  (16)1%戊二醛10min。

  (17)双蒸水振洗5min。

  (18)0.01%伊文思蓝2min,甘油封片。

  光镜下观察,小肠粘膜内含有嗜银颗粒的细胞胞浆呈红色,阳性颗粒位于细胞核底部,比单纯用PAG染色深度得到加深,阳性结果得到放大。由于抗A蛋白抗体既能通过Fab段又能够通过Fc段与PAG上的A蛋白结合,因此,与其它桥抗体相比它能够在抗原位点处聚集更多的胶体金颗粒。基本原理如下图5-3。

图5-3 PAG放大法原理

  PAG放大法的优点:①使用试剂单一;②可大大提高IGS的敏感性,从而使应用IGS方法定位抗原时使用高稀释度的抗体成为可能;③背景干净。可以预见这一新方法将很快受到人们的关注。

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