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光镜免疫金银细胞化学方法
来源:医学全在线 更新:2007/12/3 字体:

 

  五、在IGSS染色中常见技术问题和对策

  (一)背景染色产生的原因和防止方法

  (1)第一抗体或金标抗体稀释度不合适,一般容易犯抗体使用过浓的毛病,认为抗体越浓越好,结果适得其反。应该先作方阵滴定,优选最佳稀释倍数(见第一章 ),即可避免非特异性染色,又可节 省抗体。

  (2)使用正常箅清封闭和在抗体稀释液中加入牛血清白蛋白,可以减少非特异吸附,降低背景染色。

  (3)显色的器皿必须彻底清洗,化学试剂必需用三蒸馏水配制。

  (4)乳酸银和硝酸银的显色在避光的环境中反应。醋酸银则可在有光的环境中显色。

  (5)显色时切片应垂直放置在银显影液中,使过多的银颗粒下沉,如水平放置易沉淀于切片上。

  (6)控制反应时间,显影液加入适量的阿拉伯胶或明胶可以延缓反应速度,避免形成过多的还原银,非特异地吸附在切片上。一般加入明胶1%~2%,效果比较满意,反应时间根据室温而定,室温25左右显色时间10~15min,室温在20℃以下,显色时间20~30min左右。

  (7)洗涤:使用TBS时最好加入0.05%~0.1%的Triton X-100或Tween 80,可以洗脱掉组织表面发生非特异性吸附的污染蛋白,防止出现背景的非特异染色。

  (二)背景染色已发生应如何消除

  (1)2%硫代硫酸钠,1%铁氰化钾等量混合,加在切片上至背景无色为止。

  (2)2%铁氰化钾和1%溴化钾等量混合作用1min水冲洗,然后加上2%硫代硫酸钠和1%亚硫酸钠脱色,至背景干净为止。

  (3)0.1%重铬酸钾加0.25%浓硫酸,在显微镜下控制脱色时间,至阳性结果清楚,无背景为止。然后用5%硫代硫酸钠漂白。注意时间不要过长,以免阳性结果被脱掉。

  (4)用0.3%~1%的H2O2 处理切片也可消除背景的银颗粒。但必须在显微镜下控制脱水时间,防止把阳性结果脱色。

  (三)彩色显影背景过染的处理方法

  彩色免疫金银法,在胶体金技术中是一个很大的突破,它的优点是结果鲜明,对比度好,但是在彩色显影过程中时间过长,背景可有一些着色,彩色显影的时间控制很重要。一旦过染可用以下方法处理。

  (1)纯酒精滴到切片上3~5s,立即冲掉,水洗,充分地把酒精洗掉,如果洗不彻底,造成阳性结果脱色。

  (2)75%的酒精滴到切片上1min,立即冲掉,脱色不能时间过长,过长后阳性结果全部脱掉。

  六、物理显影液及缓冲液的配制

  (一)缓冲液的配制

  (1)0.05mol/l pH7.4 TBS 配制

  Tris(三羟甲基胺基甲烷)12.1g

  NaCl           17.5g

  加双蒸水        1900ml

  然后用浓HCL调至pH为7.4再加双蒸水至2000ml

  Tris        4.84g

  NaCl        17.5g

  BSA         2.0g

  NaN3      1.0g

  双蒸水1900ml,充分搅拌至溶质完全溶解,用浓HCl调pH至8.2,再加双蒸水至2000ml。

  (二)银显影液的配制

  1.乳酸银显影液的配制:混合以下溶液

  ①10%阿拉伯胶水溶液60ml

  ②枸橼酸缓冲液pH 3.5 10ml

  ③对苯二酚1g,加双蒸水20ml溶解。

  ④乳酸银水溶液100 mg加水10ml。

  注意在暗处显影。

  2.硝酸银显影液的配制

  ①10%阿拉伯胶水溶液60ml。枸橼酸缓冲液ph 3.5 10ml

  ②对苯二酸1.7g水溶液30ml。

  ③硝酸银40mg水溶液2ml。

  ①②两溶液完全溶解,临用前加入硝酸银溶液。在暗处显影。

  4.彩色显影液的配制

  ①0.2N氢氧化钠的异丙醇溶液5ml溶入100mgα-萘酚(或菲尼酮)。

  ②500mg碳酸钠,25mg溴化钾,50mg亚硫酸钠,加双蒸水25ml。

  ①②两液1:10混合,室温下彩色显影。

  5.醋酸银显影液

  ①15%阿拉伯胶60ml,柠檬酸缓冲液10ml,pH3.5。

  ②对苯二酚1.7g溶于20ml蒸馏水中。

  ③醋酸银100mg溶于蒸馏水10ml中。

  用前①②③依次混合,不需要避光,在室温下显影。

  (三)柠檬酸缓冲液的配制

  柠檬酸(C6H8O7.H2O)25.5g

  柠檬酸三钠(Na3C6H5O7.2H2O)23.5g

  加重蒸水100ml溶解即成,pH3.5

  (四)氢氧化钠(NaOH)无水乙醇饱和溶液的配制 

  8g氢氧化钠,加入100ml无水乙醇振摇溶解即成。

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