一、标本制作
可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。
二、荧光抗体染色方法
（一)直接法
1．染色 切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：8或1：16的荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等)，在室温或37℃染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。
2．洗片 倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。
3．用50%缓冲（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0～9.5)甘油封固、镜检
4．对照染色
①正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。②染色抑制试验（一步法)：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清（相同)等量混合，如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替未标记抗血清，染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。③类属抗原染色试验，前面已作叙述。
直接法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。
（二)间接法
（1)切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。
（2)再滴加间接荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等)，同上步骤，染色30min，37℃，缓冲盐水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。医学全.在.线www.lindalemus.com
对照染色：①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。③阳性对照。
间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method)。另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下：
①切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。
②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30min。
③缓冲盐水洗2次，每次5min，吹干。
④滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃，30min。
⑤如③水洗。
⑥缓冲甘油封固，镜检。
间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹)等的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。
