（三)四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC)
它是一种紫红色粉末，较稳定。其最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰（图3-9)，与蛋白质结合方式同TITC。它可用于双标记示踪研究。化学结构式如下（图3-10)。
图3-9 TMRITC在可见光区的吸收
光谱和发射光谱
图3-10 TMRITC结构式
二、荧光素标记抗体的方法
（一)FITC标记抗体的方法
1．Marsshall 氏法
（1)材料：抗体球蛋白溶液、0.5mol/l pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶（25～50ml)、冰及冰槽（或1000ml烧杯)、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯（500ml)、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等。
（2)方法及步骤：
①抗体的准备：取适量已知球蛋白浓度之溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后蛋白浓度为20mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。
②荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg 荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
③结合（或称标记)：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约5～10min内加完)，加毕后，继续搅拌12～18h。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故须及时添冰去水；亦可将结合装置安放在4℃冰箱或冰库中。
④透析：结合完毕后，将球蛋白的溶液离心（2500r/min)20min，除去其中少量之沉淀物，装入透析袋中后再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析（0～4℃)过夜。
⑤过柱：取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定（图3-11，图-3-12)。
图3-11 Sephadex G-25 对FITC
图3-12 FITC与家兔IgG球蛋白在25℃和2℃时结合的动力学（Kawamura 1964)
洗脱液：0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2);过滤量:12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析);收集量:20ml(稀释1.7倍)。
分别以1mgFITC溶于2份1mol 0.5mol/L碳酸重碳酸盐缓冲液（分别为pH9.5和pH9.0)，于2℃下搅拌将其各加入100mg家兔IgG生理盐水溶液中，搅匀后立即将每份分为两半。一半保留于2℃下，另一半置25℃下。间隔一定时间后各取出0.5ml通过sephadex G-25去游离FITC，由上计算出5mg家兔IgG结合的FITC量。
