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荧光抗体的制备
来源:医学全在线 更新:2007/12/3 字体:

 

  2.Chadwick 氏法

  (1)材料:抗原球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、0.01mol/l Ph8.0磷酸盐缓冲盐水、1%硫柳汞、离心机及离心管、三角烧瓶(25ml)、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500ml)、透析袋、棉线、玻棒等。

  (2)方法及步骤:

  ①抗体准备:用0~4℃pH8.0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30~40mg/ml,置入三角烧瓶内,放于冰槽中。

  ②荧光色素准备:按每毫克蛋白加入荧光素0.01mg计算,称取所需之荧光素量,用3%重碳酸钠水溶液溶解。

  ③将准备之抗体与荧光色素溶液等量混合,充分搅匀,在0~4℃,冰箱中结合18~24h。

  ④透析和柱层析:方法同Marshall 氏法。

  3.改良法(1963年)  根据Marshall 氏法取高价的抗人球蛋白兔免疫血清,分离球蛋白,用盐水(0.15mol/l NaCl)及缓冲液(0.15mol/l NaHCO3 –Na2CO3 PH9.0) 稀释使每毫升内含蛋白10mg,缓冲液为总量的10%,降温至4℃,加入异硫氰酸盐荧光素,(蛋白:荧光素=50~80mg:1mg),在0~4℃下电磁搅拌12~14h。然后用半饱和和硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离,除去未结合的荧光素,再用缓冲盐水透析,除去硫酸铵(用Nessler氏试剂测验至隔夜透析之盐水无氨离子及荧光色素为止)。将制备好的荧光抗体加叠氮钠0.01%,分装在1ml安瓿中,或冻干,保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上,-20℃保存可达2年以上。

  【附一】0.01mol/L pH7.2 PBS 配法:NaCl 18g 、Na2HPO41.5g、KH2PO40.2g,溶于2000ml蒸馏水中,校定pH至7.2。

  【附二】0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液配法:取0.5mol/l Na2CO3(5.3%)10ml加入0.5mol/l NaHCO3(4.2%)90ml,混合后,校定pH至9.0。

  【附三】3%重碳酸钠水溶液配法:称1.5g无水重碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。

  4.透析标记法   此法适用于小量抗体的荧光素标记,标记简便,非特异性染色较少。

  (1)用0.025mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0,将欲标记免疫球蛋白稀释成1%浓度,装入透析袋中。

  (2)用同一缓冲液将FITC配成0.1mg/ml的溶液,按1%球蛋白液体积的10倍,将FITC稀释液盛于圆柱形容器内,并使透析袋浸没于FITC液中。容器顶端盖紧,底部放搅拌棒,在4℃电磁搅拌下,透析标记24h。取出透析袋中标记液,即刻用sephadex G-50 凝胶过滤,去除游离荧光素,分装、贮存于4℃中(图3-13)。

图3-13 标记抗体溶液通过sephadex 产胶柱层析分布

  (二)四乙基罗达明标记抗体方法

  取1g RB200及PCL52g放在乳钵中研磨5min(在通风橱中)。然后加入10ml无水丙酮,放置5min,不断搅拌。过滤,用滤液进行标记抗体。剩余部分吸附在滤纸上,4℃干燥保存。

  取抗体(20mg/ml)每毫升加入生理盐水和0.5mol/l pH9.0的碳酸盐缓冲液各1ml稀释。逐滴加入0.1ml RB200溶液,边加入边搅拌,在0~4℃中结合12~18h,再用生理盐水透析5~7h,经葡聚糖凝胶G-50柱层析,除去游离荧光素,分装,贮存于4℃备用。

  (三)四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法

  (1)Igg 10ml (6mg/ml)在0.01mol/l pH9.5碳酸盐缓冲液中透析过夜。

  (2)将四甲基异硫近氰酸罗达明(每毫克IgG加入5~20μg)溶于二甲亚砜(1mg/ml),取此溶液300μl,一滴一滴加入蛋白质溶液中,同时电磁搅拌。

  (3)在室温中搅拌2h,避光。

  (4)把结合物移入直径3cm,高30cm大小的Bio –Gel P-6层析柱(用0.01mol/l pH8.0的PBS平衡过),流速为1.5ml/min。

  (5)收集先流出的红色结合物,即为标记抗体,分装,4℃保存备用。

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