2．Chadwick 氏法
（1)材料：抗原球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、0.01mol/l Ph8.0磷酸盐缓冲盐水、1%硫柳汞、离心机及离心管、三角烧瓶（25ml)、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml)、透析袋、棉线、玻棒等。
（2)方法及步骤：
①抗体准备：用0～4℃pH8.0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg/ml，置入三角烧瓶内，放于冰槽中。
②荧光色素准备：按每毫克蛋白加入荧光素0.01mg计算，称取所需之荧光素量，用3%重碳酸钠水溶液溶解。
③将准备之抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在0～4℃，冰箱中结合18～24h。
④透析和柱层析：方法同Marshall 氏法。
3．改良法（1963年) 根据Marshall 氏法取高价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水（0.15mol/l NaCl)及缓冲液（0.15mol/l NaHCO3 –Na2CO3 PH9.0) 稀释使每毫升内含蛋白10mg,缓冲液为总量的10%，降温至4℃，加入异硫氰酸盐荧光素，（蛋白：荧光素=50～80mg:1mg)，在0～4℃下电磁搅拌12～14h。然后用半饱和和硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵（用Nessler氏试剂测验至隔夜透析之盐水无氨离子及荧光色素为止)。将制备好的荧光抗体加叠氮钠0.01%,分装在1ml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中（4℃)可以用半年以上，-20℃保存可达2年以上。
【附一】0.01mol/L pH7.2 PBS 配法：NaCl 18g 、Na2HPO41.5g、KH2PO40.2g,溶于2000ml蒸馏水中，校定pH至7.2。
【附二】0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液配法：取0.5mol/l Na2CO3(5.3%)10ml加入0.5mol/l NaHCO3(4.2%)90ml,混合后，校定pH至9.0。
【附三】3%重碳酸钠水溶液配法：称1.5g无水重碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。
4．透析标记法 此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。
（1)用0.025mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0，将欲标记免疫球蛋白稀释成1%浓度，装入透析袋中。
（2)用同一缓冲液将FITC配成0.1mg/ml的溶液，按1%球蛋白液体积的10倍，将FITC稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4℃电磁搅拌下，透析标记24h。取出透析袋中标记液，即刻用sephadex G-50 凝胶过滤，去除游离荧光素，分装、贮存于4℃中（图3-13)。
图3-13 标记抗体溶液通过sephadex 产胶柱层析分布
（二)四乙基罗达明标记抗体方法
取1g RB200及PCL52g放在乳钵中研磨5min（在通风橱中)。然后加入10ml无水丙酮，放置5min，不断搅拌。过滤，用滤液进行标记抗体。剩余部分吸附在滤纸上，4℃干燥保存。
取抗体（20mg/ml)每毫升加入生理盐水和0.5mol/l pH9.0的碳酸盐缓冲液各1ml稀释。逐滴加入0.1ml RB200溶液，边加入边搅拌，在0～4℃中结合12～18h，再用生理盐水透析5～7h，经葡聚糖凝胶G-50柱层析，除去游离荧光素，分装，贮存于4℃备用。
（三)四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法
（1)Igg 10ml (6mg/ml)在0.01mol/l pH9.5碳酸盐缓冲液中透析过夜。
（2)将四甲基异硫近氰酸罗达明（每毫克IgG加入5～20μg)溶于二甲亚砜（1mg/ml),取此溶液300μl，一滴一滴加入蛋白质溶液中，同时电磁搅拌。
（3)在室温中搅拌2h，避光。
（4)把结合物移入直径3cm,高30cm大小的Bio –Gel P-6层析柱（用0.01mol/l pH8.0的PBS平衡过)，流速为1.5ml/min。
（5)收集先流出的红色结合物，即为标记抗体，分装，4℃保存备用。
