微 信 题 库 搜 索
理论教学
内科学
风湿病学 神经病学 免疫与健康
儿科学 老年医学 更多
外科学
皮肤性病学 普通外科学 烧伤外科学
神经外科学 外科学总论 更多
其它科目
基础学科 临床专科 内科疾病
内科诊疗 外科诊疗 专科诊疗
外科疾病 专科疾病 临床专科疾病
 医学全在线 > 理论教学 > 基础学科 > 免疫细胞与核酸分子杂交 > 正文
免疫球蛋白抗体的提取与纯化
来源:医学全在线 更新:2007/12/3 字体:

 

  (二)注意事项

  (1)柱的选择:从理论上说,只要柱足够长,就能获得理想的分辨率,但由于层析柱流速同压力梯度有关,柱长增加使流速减慢,峰变宽,分辨率降低。柱的直径增加,使流体流动的不均匀性增加,分辨率明显下降。

  (2)纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度 。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后,才能进行柱层析。

  (3)所装的柱床必须表面平整,无沟流及气泡,否则应重装。

  (4)洗脱过程中应严格控制流速,切勿过快。

  (5)上样的体积要小,浓度不宜过高。

  (6)加样及整个洗脱过程中,严防柱面变干。

  四、SPA-Sepharose CL-4B 亲合层析纯化 IgG及IgG亚类

  (一)原理

  葡萄球菌A蛋白(SPA)具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力,并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-Sepharose CL-4B 柱上的IgG或不同的 IgG 亚类,可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。

  (二)操作步骤

  用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-Sepharose CL-4B凝胶,15min。按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶,(用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤)。

  ↓

  装柱后用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡。

  标本可用硫酸铵粗提物,先10000g离心除去杂质,必要时用0.22μm滤膜过滤,上样前用1mol/L pH9.0 Tris 液调整标本液pH至8.1或对平衡液透析过夜。

  ↓

  加样,一般按25~30mg IgG/g湿胶比例加样,室温作用15min,用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液充分淋洗,到淋洗液OD值为<0.02。

  ↓

  用不同pH的枸橼酸洗脱液洗脱,流速20ml/h。如纯化小鼠IgG1一般用pH6.0;纯IgG2a用pH4.0 ;纯化IgG2b用0.1mol/L pH3.0醋酸盐缓冲液0.1mol/L pH3.0glycine-HCl缓冲液洗脱。

  ↓

  用pH3.0或4.0洗脱液洗脱时,用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液。

  ↓

  收集洗脱液测OD值,根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。

  (三)试剂器材

  (1)SPA-Sepharose CL-4B (pharmacia)

  (2)磷酸缓冲液0.1mol/L pH8.0+0.02% NaN3

  (3)枸橼酸缓冲液

  0.1mol/LpH6.0

  0.1mol/LpH4.0     +0.02%   NaN3

  0.1mol/LpH3.0 

  (4)1mol/L pH9.0 Tris溶液

  (5)再生缓冲液:①0.1mol/L Tris含0.5mol/L NaCl调整pH至8.5+0.02% NaN3;②0.1mol/L 醋酸钠含0.5mol/L NaCl调整pH至4.5+0.02%NaN3。

  (四)注意事项

  (1)SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵,可再生后反复使用10~20次左右。方法:

  先用10倍柱体积0.1mol/L pH8.5 Tris含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白;再用10倍柱体积0.1mol/L pH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白;0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡,4℃贮存。

  (2)SPA-Sepharose CL-4B亲 合层析法还可用于:①除去抗体液中IgG,检测非IgG抗体(如IgM)的生物学活性;②除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段;③吸收或纯化免疫复合物。

  (3)狗、的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。

上一页  [1] [2] [3] [4] [5] 下一页

相关文章
抗体的制备
荧光抗体的制备
细胞因子及其受体的结构
人体的“食品加工厂”:消化道
诺氟沙星治疗幽门螺杆菌阳性胃炎142例抗体
   触屏版       电脑版       全站搜索       网站导航   
版权所有:医学全在线(m.med126.com)
   触屏版       电脑版       搜索   
版权所有:医学全在线(m.med126.com)
网站首页
频道导航
医学论坛
返回顶部
Baidu
map