一、国内实验室应用试剂配制
(一)培养液
(1)RPMI1640培养液:称取RPMI培养基9.8g,碳酸氢钠1.9g、青霉素100u/ml,加双蒸水至1000ml,调节 pH7.2~7.4无菌过滤冻存备用。
(2)小牛血清商品:成都生物制品厂。
(3)植物凝集素(PHA):自制或成品(重庆药检所)。
(4)pH调整液:5%NaHCO3溶液高压灭菌(8磅15min),0.1N稀盐酸液100ml。
(5)秋水仙素:10mg/ml无菌过滤高压灭菌(8磅10min)。
(6)磷酸缓冲液:pH7.4。
磷酸氢二钠28.8g(H2O)、磷酸二氢钾2.67g(无水),溶于1000ml双蒸水中,加肝素,终浓度为100u/ml。
(7)Giemsa染色液:
Giemsa粉剂 1g
甘油 66ml
在研钵中,加入少量甘油油仔细研磨然后放甘油全部加磨,60℃温箱中保温2h,冷却后加入甲醇66ml。装入有色瓶中混合待用。染色时用pH7.4磷酸缓冲液稀释10倍,随配随用。医.学.全.在线.网.站.提供
(二)固定液
(1)甲酸:冰乙酸3:1混合即用。
(2)PBS缓冲液配制:
NaCl 16g Na2HPO4(12H2O) 5.65g
KCl 0.4g KH2PO4 0.4g
加双蒸水至1000ml pH7.0。
取5%胰酶(生理盐水配制)1ml加入50ml PBS液中(最终浓度为0.025%),4℃冰箱待用。
二、细胞培养(Bhatl B和McGee JOD,1990)
1.完全培养基
RPMI 76.0ml
胎牛血清 20.0ml
植物凝集素 2.0ml
抗生素/抗菌素溶液(100×) 1.0ml
L-谷氨酰胺(100×) 1.0ml
2.BudR(5’-Bromo-2-deoxyuridine, 5’-溴-2-脱氧尿嘧啶)溶解10mg/ml BudR于dH2O中,0.2μm滤膜过滤除菌,分装后-20℃储存,BudR要在柔光(弱光)下操作。
3.胸腺嘧啶(Thymidine,Thd) 按250μg/ml溶解于dH2O中,过滤后分装储存于-20℃。
4.Colcemid(Sigma) 5.0μg/ml溶于dH2O中,过滤后分装储存于-20℃。
5.KCl(0.75mol/L) 溶解560mg于100ml dH2O中,新鲜配制37℃保存。
6.固定剂 甲醇冰醋酸按3:1(V/V)混合即可,现用现配,置冰上待用。
7.缺口平移试剂盒(Amersham和BRL公司)
8.生物素7-dATP(BRL)
9.糖原(BRL)