(四)载片的包被(粘贴)
1.沾附剂
(1)多聚赖氨酸(poly-L-Lycine,PLL)
储备液(0~5%)
按上述剂量充分混合,即为浓度为5mg/ml(0.5%)的PLL液。常分装成1ml的包装,-20℃存放。该液为储备液,可反复冻融,无明显影响。用前充分混合。
工作液(0.01%):
充分混合,静止待气泡消失。
(2)明胶液
配法:先称取明胶溶于500~800ml DEPC水中,加热搅拌助溶,待明胶完全溶解以后,加入甲明矾溶解后即可使用。注意,包被玻片时,明胶液温度最好保持在60℃左右,效果最佳。方法同PLL包被玻片。
2.多聚赖氨酸包被玻片的制备方法(其它包被剂相同)
(1)将事先准备好的经160℃以上烘烤,并冷却至室温的玻片(载片或盖片),在0.05%(也有用0.1%)的PLL液中上下浸蘸几下,分散开竖放在架子上,于空气中自然干燥,4℃备用。注意:①浸蘸时,务必使整个玻片完全浸于液体中,否则,包被不完全会产生标本脱落现象;②干燥过程中注意避免尘埃污染;③按上法处理的玻片通常可存放在一定时间(室温1月以上,4℃更长),但仍建议尽早使用。
(2)多聚赖氨酸1mg溶于10ml灭菌的去离子水或1mmol/L的Tris-HCl缓冲液中(pH7.0),将其涂布于玻片上,待干燥后即可使用。该法包被的玻片可用于细胞涂片和切片。
(3)将PLL工作液滴至盖玻片上5μl/片,用另一盖玻片以推血涂片方法推片,或用另一盖玻片紧贴于其上,相互磨擦以使两盖玻片相对的一面涂布上PLL。该法制备的玻片,只有一面是包被有PLL,故制备时,待其晾干后,应作好记号,然后保存后备用。
多聚赖氨酸可用于多种核酸杂交,方法简单,结果可靠,有许多其它方法不可比拟的优点。配制好的液体可存放于4℃或室温,但时间过长会解聚而失效,故建议使用时尽量新鲜配制。
(4)Vectabond粘附剂
该试剂是Vector公司新近推出的一种新型粘附剂。它与其它粘附剂的主要区别是:一般的粘附剂是通过物理性覆盖在玻片表面,天长日久,可能由于包被不完全或局部脱落而致切片等标本易于脱落。而Vectabond试剂是通过化学性作用,改变玻璃表面的分子结构,使标本贴附牢固,不易脱落,且保持时间长久,耗量小,价格便宜,一个包装7ml可配成350ml工作液使用。操作程序:
标本(铺片、切片等)→丙酮(5min)→Vectabond试剂工作液(5min)→dH2O(2×5min)→干燥(温箱,数小时过夜)→用铝箔包好,室温备用。
注意:制备和保存过程中避免污染。
经上述处理的载玻片一般可存放半年以上(4℃可更长)。
(五)硅鱼精子DNA的制备
(1)在50ml灭菌聚乙烯管中加入1g鲑精DNA,加入15ml DEPC水使其浸泡5min至2h;
(2)加入2.5ml 2mol/L HCl,室温放置,DNA形成白色沉淀,充分振摇至沉淀物相互缠绕在一起,用吸头尖端使之形成一球团状(2~3min);
(3)加入5.0ml 2mol/L的NaOH。摇动小管使DNA悬浮、溶解,将小管置50℃15min助溶;
(4)用DEPC水将混合物稀释至175ml(总体积),充分混合,注意确保管内已无颗粒状;
(5)加入20ml/l 1mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4);
(6)用2mol/L的HCl滴定至DNA溶解pH为7.0~7.5;
(7)用无菌微孔滤膜过滤液体,去除颗粒。260nm测定溶液的OD值,方法是:取20μl DNA液混合于980μl水中,混匀后测定,吸收值乘以50即为DNA浓度(μg/ml);
(8)制备好的DNA液储于-20℃备用,用前取出冻融后煮沸。