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原位杂交组织化学常用试剂及处理
来源:医学全在线 更新:2007/12/3 字体:

  (四)DNA探针标记常用试剂的配制

  (1)10 ×缺口平移缓冲液:200mmol/l Tris-HCl,pH7.4含50mmol/L MgCl2;100mmol/Lβ-巯基乙醇、1mg/ml BSA。

  (2)缺口平移反应终止液:200mmol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4; 11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。

  (3)DNaseⅠ:干粉状DNaseⅠ(2000~3000u/mg)溶于20mmol/l Tris-HCl, pH7.5中(1mg/ml),10μl分装,-20℃保存一年。

  (4)10×DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)缓冲液:500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L Mg-Cl2;10mmol/L DTT;0.5mg BSA。

  (5)10×激酶缓冲液:500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl2;20mmol/L DTT; 1.0mmol/L亚精胺。

  (6)10×随机引物标记缓冲液;500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/L β-巯基乙醇;500μg/ml BSA。

  (7)1×加尾缓冲液:100mmol/L二甲胂化钾,pH7.0,1mmol/l CoCl2 0.2mmol/L DTT。

  (8)1mol/L MgCl2:MgCl2 47.60g溶于500ml水中,100ml分装,高压灭菌,室温保存。

  (9)0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02g溶于400ml水中,调pH至8.0,加水至500ml,100ml分装,高压灭菌,室温保存。

  (10)4mol/L醋酸钠:取无水醋酸钠82g溶于200ml水中,用醋酸调pH至6.5,加水至250ml,高压灭菌,或0.45μm膜过滤,室温保存。

  (11)10% SDS:10g SDS(十二烷基硫酸钠)溶于50ml水中,加水至100ml,分装后室温保存。

  (12)20×SSC:取NaCl 175.3g;柠檬酸钠88.2g;加水至1000ml,用10mol/l NaOH调pH至7.0;高压灭菌,室温保存。

  (13)无菌水:100ml去离子水或双蒸水,分装,高压灭菌,室温保存,开瓶后仅限一周使用。

  (14)10×激酶缓冲液:500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl2;50mmol/l DTT;10mmol/L亚精胺(非必需)。

  (15)T4多聚核苷酸激酶:10u/μl,保存在甘油中,-20℃。

  (16)TE缓冲液(Tris/EDTA):Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/L贮存液),1.0mmol/l ED-TA,pH8.0(20μl 0.5mol/L)贮存液,加水至100ml,室温保存。

  (17)2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g溶于850ml,加浓HCl 75ml ,边加边缓慢搅动,至pH7.4,于加水至1000ml。

  (18)1mol/L DTT(二硫苏糖醇):3.0g DTT溶于20ml水中,分装,于-20℃贮存。

  (19)0.5mol/L EDTA(乙二胺四乙酸二钠盐):在烧杯中先加入300ml水,加入93.5g EDTA-Na2·2H2O,充分混匀,加10mol/l NaOH调pH至8.0,加水至500ml。

  (20)10mol/L NaOH:200g NaOH溶于450ml水中,混匀,再加水至500ml。

  (21)5mol/L NaCl:292.25g NaCl,加水至1000ml。

  (22)1mol/L HCl:加86.2ml浓盐酸至913.8ml水中。

  (23)1mol/L CaCl2:147g CaCl2:2H2O,溶于1000ml水中,高压灭菌,室温保存。

  三、固定剂

  进行原位杂交的组织或细胞标本常需经固定处理。尽管许多化学物质对组织/细胞有固定作用,但核酸原位杂交的理想固定液应具备如下特点:①能很好地保持组织细胞的状态;②对核酸无抽提、修饰及降解作用;③不改变被检核酸分子在组织细胞内的定位;④对核酸及探针的杂交过程无阻碍作用;⑤固定液本身对杂交信号无遮蔽、掩盖作用,如不使本底增加等;⑥理化性质稳定、价格低廉。

  1.4%多聚甲醛(Paraformaldehyde,PFA)

  配法:称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器(烧杯或烧瓶)中,持续加热磁力搅拌至60~65℃,使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0,使呈清亮状(滴加),再加入约500ml 2×PBS,充分混匀(在冰浴或冷水浴中),可再检测一下pH,过滤后定容至1000ml,室温或4℃保存备用。

  注意:①配制时应在通风条件下操作,并避免接触皮肤和吸入(戴手套及口罩),因PFA有较强的固定作用及毒性,对粘膜及皮肤有固定及毒性,刺激作用;②加热时,温度不宜过高,常为60~65℃,否则,PFA降解失效;③配制好的PFA虽可存放一定时间,但过久的液体,固定效果下降,建议尽早使用。

  附:固定液用PBS的配制:

  配法:按上述比例称取试剂,溶于DEPC水(也可用蒸馏水加DEPC)500~800ml中,过滤后,加水定容至1000ml,高压灭菌。通常配制成10×PBS的储备液,2×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。

  除用DEPC水配制PFA外,也有用灭菌蒸馏水或经DEPC处理的0.01~0.1mol/L的PBS配制的,方法及注意事项同上。

  4% PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液,它能较好地保持组织及细胞内的RNA,同时对形态保持也较好。通常组织块固定4~12h,载片固定时间在10~15min以内,RNA含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联,影响探针的穿透力,降低杂交效率。

  2.甲醛

  ①10%甲醛(Formaldehyde,FA)

  量取二者充分混合而可。较适于检测RNA的组织及细胞固定,也可用于新鲜冰片切片后固定。

  ②10%福尔马林试剂:

  较适于固定细胞。

  ③10%中性福尔马林

  市售甲醛           100ml

  Na2HPO4                4g

  NaH2PO4               6.5g

  DEPC水           ~1000ml

  常用于石蜡样品切片的固定。

  10%的甲醛由于有促进DNA双链分子交联的作用,干扰DNA变性,故不适于DNA杂交。在组织或细胞原位杂交中,可通过使用含50%甲酰胺的杂交液使DNA变性解链而解决。这类固定液在DNA/RNA杂交中有较好的效果。

  3.4%戊二醛效果较40%差。

  4.0.1%戊二醛常用于固定组织,适于新鲜组织冰冻切片及石蜡切片的后固定,常用于检测DNA的原位组织杂交方法。

  5.乙醇/醋酸(或冰醋酸)将乙醇与醋酸按3:1的体积比充分混合即可。该液较适于固定细胞的原位杂交,尤其检测DNA时。

  乙醇/醋酸虽广泛应用于原位杂交中,但RNA保留较差,可本底很低,即背景染色淡。

  6.甲醇/醋酸(3:1)用前按体积比3:1比例充分混合即可。

  7.甲醇/丙酮(1:1)适于培养细胞的原位杂交技术。

  8.4%多聚甲醇-0.5%~1%戊二醛溶液在pH7.4磷酸缓冲液中,用于免疫电镜样品固定。

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