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原位杂交组织化学常用试剂及处理
来源:医学全在线 更新:2007/12/3 字体:

 

  四、LB培养基

  (一)液体LB培养基(Luria-Bertani培养基)

  配制:取一1000ml的烧杯,将事先称取好的试剂加入杯内,加H2O约500~800ml搅拌使其溶解完全。用5N的NaOH调pH至7.0,加入H2O定容至1000ml。15磅高压灭20min。

  (二)琼脂糖平板培养基 

  细菌培养用琼脂(或琼脂糖)    15g

  液体培养基(如LB)        ~1000ml

  按浓度比例,将琼脂加入液体培养基(如LB)中,稍加搅拌,用纱布或纸封好瓶口,15磅高压灭菌20min。

  五、小量质粒提取主要液体

  1.溶液Ⅰ

  2.溶液Ⅱ

  3.溶液Ⅲ(3mol/L醋酸钠)

  加热溶解后,再用冰醋酸(约40ml)调pH至4.8,补足H2O至200ml。

  六、杂交前处理

  1.蛋白酶(Proteinawe K, Pro.K) 蛋白酶K主要用于杂交前标本处理,其作用是使组织达到一定消化,利于检测分子的穿透,从而提高检测方法的敏感性,但各种组织在不同条件下消化程度不一,因此,具体应用时,应根据组织种类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏,核酸分子也会受到影响。通常是将其配成储备液(1mg/ml),临用前,再配成工作液(约0.025mg/ml)。配制方法:

  精心称药,将二者充分混合后,分装成小份,-20℃存放,用时再取出冻融,余者弃去。

  (2)工作液(临用前配):

  取储备液(1mg/ml)按1:40稀释,充分混合,即得约含Pro.K为25mg/ml的工作液。

  (3)关于P-K缓冲液的配制:

  称取上述试剂,充分混合即可。

  ②1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0):

  先将Tris于800ml ddH2O中溶解,用HCl将pH调至8.0,ddH2O定溶于1000ml,高压灭菌,室温备用即可。

  ③0.5mol/L的EDTA:

  称取EDTA溶于约600ml ddH2O中,常需60℃持续搅拌以助溶,滴加NaOH至pH接近8.0时,EDTA才开始溶解。待完全溶解后,冷却至室温,NaOH调pH至8.0,ddH2O定溶至1000ml,高压灭菌,室温备用。

  2.甘氨酸

  (1)1mol/L甘氨酸:

  称取甘氨酸75g溶于ddH2O或DEPC水中,最后补足ddH2O定容至1000ml,高压灭菌备用。该液为储备液,-20℃储存。

  (2)甘氨酸工作液(0.1mol/L):

  将二者按1:10比例稀释,即得甘氨酸工作液。一般要求临用前新鲜配制。

  甘氨酸有终止蛋白酶K作用的作用,以防过度消化。

  3.0.25%醋酸-0.25%醋酸酐

  配制:按上述配方,先以少许DEPC水溶解NaCl,然后加入三乙醇胺及浓HCl。DEPC水定容至约1000ml(997.5ml),临用前,一边摇动溶液一边加入醋酸酐,充分混合。注意操作时避免浓HCl 溅出,最好在通风条件下进行。

  生物体内有些组织,如神经组织中的蛋白质,对带负电荷的核酸探针较易吸附。经该液乙酰化处理后,可使切片标本表现带上负电荷,有排斥带负电的核酸探针,减少非特异吸附,降低反应背景的作用。

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