六、酶消化液
1.0.1%胰蛋白酶
试剂:胰蛋白酶 0.1gm
0.1%氯化钙(pH7.8) 100ml
配制方法:先配制0.1%的CaCl2,用0.1mol/L的NaOH将其pH调至7.8,然后加入蛋白酶溶解之。用前将胰蛋白酶消化液在水浴中予热至37℃(载有标本的玻片也在TBS中予热至同样样温度)。该消化液时间约为5~30min。
2.0.4%胃蛋白酶
试剂:胃蛋白酶 400mg
0.1N HCl 100ml
配制方法:同胰蛋白酶。消化时间在37℃约为30min。
3.0.06% Pronase
试剂:Pronase 0.06g
0.05mol/L TB(pH7.5) 100ml
配制方法:同前。
在免疫细胞化学染色中,有时经Formalin过度固定的标本,常会产生过量的醛基,遮盖抗原,影响一抗与抗原的结合。用蛋白酶溶液消化,可起到暴露抗原部分的作用。消化时间应根据不同组织而异,总之,在保持组织形态不被破坏的前提下,宜尽量延长消化时间。以上三种酶消化液中,以第一种最为常用。
七、其它
1.蔗糖溶液 免疫细胞化学中应用的蔗精,常用浓度为5%~30%。一般光镜研究,仅用20%蔗糖处理已足矣,若制备电镜标本,在冰冻前最好经上行蔗糖(5%、10%、15%、20%及20%蔗糖-5%甘油等)处理,以确保其良好的细微结构。
(1)20%蔗糖液:
试剂:蔗糖 20g
0.1mol/L PB(pH7.5) 至100ml
配制方法:先以少许0.1mol/L的PB溶解蔗糖,再加0.1mol/l PB至100ml充分混合,置4℃冰箱保存。
该液多用于纯光镜研究。标本在刚放入浓度如此高的蔗糖液,常浮在上面,当标本沉到底部时即可。通常光镜标本浸泡在20%蔗糖液中过夜。都能达到要求。
(2)20%蔗糖-5%甘油:
试剂:蔗糖 20g
甘油 5ml
0.1mol/L PB 至100ml(约95ml)
配制方法:先用少许PB溶解蔗糖后,再加入甘油,充分混匀,最后补足PB至100ml,于4℃保存备用。
该液主要用于电镜标本的处理,常浸泡过夜(其它浓度的蔗糖中常分别为2h左右)。
蔗糖是一种廉价的防冻剂,兼有脱水的作用,它可减小标本在冰冻切片时冰晶形成的数量和大小,应用较为方便。若无试剂蔗糖(Sucrose)也可用普通蔗糖(Cane Sugar)。配制好的蔗糖溶液,放置时间超过一个月时,应重新配制。
2.T riton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 免疫细胞化学中,Triton X-100常用浓度为1%和0.3%,但通常是先配制成30%的Triton X-100储备液,临用时稀释至所需浓度。
30% Triton X-100的配制:
试剂:Triton X-100 28.2ml
0.1mol/L PBS(pH7.3)或0.05mol/l TBS(pH7.4) 72.8ml
配制方法:取Triton X-100及PBS(或TBS)混合,置37℃~40℃水浴中2~3h,使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀释至所需浓度。
Triton X-100是一种非离子型表面活性剂(或称清洁剂),分子量为646.86(C34H62O11)。它能溶解脂质,以增加抗体对细胞膜的通透性。1%的Triton X-100常用于漂洗组织标本,0.3%的Triton X-100则常用于稀释血清,配制BSA等。
3.甲醇-H2O2液
试剂:纯甲醇 10ml
30% H2O2 0.1ml
配制方法:吸取30%的H2O20.1ml,加入100ml纯甲醇中,充分混匀即可,使H2O2终浓度为0.3%(也有的用0.03%、0.5%等)。
甲醇-H2O2处理组织标本,具有封闭内源性过氧化物酶活性的作用,但其具体机制至今仍不详。通常处理时间在室温约为5~30min。注意,用H2O2处理标本,对某些抗原的抗原性有影响,故建议在使用新的抗血清或抗原时,最好同时设立非处理对照组。
4.常用生理盐液
常用生理盐液的成分(g/1000ml)
Kerbs | Kerbs-Hen-selsit | Locke | Tyrode | Ringer | |
NaCl |
5.54 |
6.92 |
9.00 |
8.00 |
6.50 |
KCl |
0.36 |
0.35 |
0.42 |
0.20 |
0.14 |
MgCl2 |
- |
- |
- |
0.10 |
- |
MgSO4·7H2O |
0.29 |
0.29 |
- |
- |
- |
CaCl2 |
0.28 |
0.28 |
0.24 |
0.20 |
0.12 |
NaH2PO4 |
- |
- |
- |
0.05 |
0.01 |
KH2PO4 |
0.16 |
0.16 |
- |
- |
- |
NaHCO3 |
2.10 |
2.10 |
0.15 |
1.00 |
0.20 |
Glucose |
2.10 |
- |
1.00 |
1.00 |
2.00 |
Pyruvic acid |
0.43 |
- |
- |
- |
- |
Fumaric acid |
0.62 |
- |
- |
- |
- |
Glutamic acid |
0.72 |
- |
- |
- |
- |
配制方法:精确称取各种药品(如上表),加入500ml重蒸水中,待完全溶解后,补足重蒸水至1000ml,充分混匀即可。
在免疫细胞化学实验中,某些物质不宜经固定剂作用或经固定剂作用后仍易丢失,而需浸泡在生理盐液中。这些生理盐液的成分与正常哺乳动物血清的成分相似,能使组织离体后能处于尽量接近生理状态时的环境。Glucose通常是在用前临时加入。有的(如Kerbs液)在使用时通常需通入含CO2/O2为2.5~5%/97.5~95%的气体。这些生理盐液中的CO2和二碳酸盐,主要起缓冲作用,Glucose主要是提供离体组织有限的代谢所需的能量。