一、质粒DNA的提取及鉴定
(一)质粒DNA的提取及鉴定
1.收获细菌
(1)将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中,接入一单菌落,于37℃剧烈振荡培养过夜。
(2)将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中,用台式离心机于4℃以12000g离心5min,将剩余的培养物贮存于4℃。
(3)吸尽培养液,使细菌沉淀尽可能干燥。
2.碱裂解法小量抽提质粒
(1)将细菌沉淀[上述步骤(3)所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖,25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA)中,剧烈振荡。
(2)加200μl新配制的溶液Ⅱ(0.2mol/l NaOH, 1%SDS),缓和振荡,水浴5min。
(3)加150μl预冷溶液Ⅲ(50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml),缓和振荡,冰浴5min。
(4)4℃以12000g离心5min,将上清转移到另一离心管中。
(5)可作不可作:加等量饱和酚,氯仿,振荡混匀,重复2,(4)。
(6)用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA,振荡混合,于室温放置2min。
(7)4℃以12000g离心5min。
(8)小心吸尽上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,再将附于管壁的液滴除尽。
(9)用75%乙醇于4℃洗涤DNA,同上离心去上清真空抽干。
(10)加50μl的1×TE(含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶),振荡,贮存于-20℃。
(二)质粒DNA的大量制备
(1)同上1.(1)
(2)将1ml含菌液倒入含相应抗生素的Lb 100ml中,37℃振荡培养至A590=1.0(5~6h)。
(3)加氯霉素(170μg/ml)扩增,37℃温箱中培养过夜。
(4)收集菌液于离心管中,冰浴10min。3000rpm,离心10min,去上清。
(5)加溶液Ⅰ5ml悬浮菌体,将悬液倒入高速离心管中,摇匀,冰浴5min。
(6)加溶液Ⅱ10ml轻轻混匀,室温下5min。
(7)加溶液Ⅲ7.5ml轻轻混匀,冰浴30min。15000rpm,4℃离心20min。
(8)取上清液于高速离心管中,加2倍体积的无水乙醇,混匀,入-20℃3~5h。
(9)15000rpm 4℃ 离心20min。
(10)弃上清,将离心管倒放入真空泵中抽干(10~15min)。
(11)用5ml1×TE溶解,加入RNase A 15~20μl,42℃水浴4h于过夜。
(12)加入5ml饱和酚,混匀,4000~5000rpm离心5min,取上清液入5ml离心管内。
(13)分别加入2.5ml饱和酚,2.5ml氯仿,混匀后同样离心收集上清。
(14)加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混匀,同样离心收集上清。
(15)加入1/10体积的3mol/l NaAc及2倍体积的无水乙醇于-20℃3~5h。
(16)10000rpm 4℃离心20min。
(17)弃上清,加入75%乙醇洗涤2次。
(18)离心弃上清,真空抽干,加入适量1×TE溶解质粒DNA。
(三)质粒DNA的鉴定
1.酶切反应
(1)在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl,10×Buffer 1μl,DNA 2μl,酶1μl,混匀,37℃水浴1h以上。
(2)取反应物点样,观察酶切效果。
(3)酶切完全后,70℃5min终止反应。
2.琼脂糖电泳
(1)配制所需浓度琼脂糖凝胶。
(2)在待测的DNA样品中加1/5体积的溴酚蓝指示剂,混匀后点样。
(3)打开电源开关,5V/cm电泳。医学全在线网站www.med126.com
(4)在UV灯下观察电泳结果。
二、DNA的重组
(一)DNA的酶切与连接
(1)酶切反应
同质粒DNA的鉴定,只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切,则成比例增加。
(2)加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀,-20℃2h以上。
(3)15000rpm离心15min,弃上清。
(4)加入75%乙醇洗涤2次,离心弃上清,真空抽干。
(5)加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。
(6)测定DNA的含量。
(7)加入线性载体DNA和含量3~4倍于载体的待插入DNA片段,连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl,在12~14℃反应12~16h。
(8)连接反应液可置-20℃保存,供转化用。
(9)关于待插入DNA片段的获得参见附注。