(五)排除实验中问题的方法
1.DNA不能有效地被标记时考虑
(1)用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀,重新纯化DNA。
(2)标记反应的保温时间延长(增至20h)。
(3)DNA变性或许不完全,这时对大片段DNA特别重要。
2.不能达到预期的灵敏度时考虑
(1)DNA标记率。
(2)增加标记DNA的浓度或增加杂交时间。
(3)显色反应的时间可延长至3d。
3.若显色时背景过深,可采取
(1)在杂交溶液中减少标记DNA量。
(2)增加杂交溶液的体积,使膜随意漂浮在溶液中。
(3)某些类型的尼龙膜可能产生深色背景,因此可采用其它类型的尼龙膜或改用硝酸纤维素膜。
(4)在杂交和检测过程中增加封阻试剂的浓度。
四、核酸的分子杂交
核酸分子的固相杂交是将待测核酸样品结合在某种固相支持物上,然后与溶液中的标记探针进行杂交。目前使用最多的固相支持物是硝酸纤维膜。这里重点介绍直接点样技术,转移技术及其它常用的杂交技术。
(一)斑点杂交的直接点样法
斑点杂交或叫打点杂交(dot-blot hybridization),其主要特点是事先不用限制内切酶消化或用凝胶电泳分离核酸样品,操作简便,灵敏度高。一个点样品只含0.25~1pg的DNA也能检测到。但不知道杂交片段的大小(碱基对数)。
1.DNA的打点法(DNa Dot Blot)
(1)膜的处理:戴上干净手套,取出硝酸纤维膜,按需要剪成一定大小,量好各样点间距离,用软铅笔标记。
(2)DNA变性:将DNA溶液于1×TE(pH8.0)缓冲液中或蒸馏水中,取一定量DNA样品加于小塑料管中,在100℃沸水中煮10min,迅速入冰水中。
(3)点样:用塑料或硅化玻璃或微量加样器取1~5μl变性DNA,将滴管放在硝酸纤维膜上,使DNA慢慢吸在滤膜上,点样完后凉干。
(4)固定:将凉干的滤膜夹在滤纸中,于80℃干烤2~3h,然后进行杂交。
2.RNA的打点法(RNa Dot Blot)
(1)膜的处理:同DNA的打点法。
(2)RNA变性:将提取的RNA与50μl 20×SSC/甲醛(30μl 20×SSC加20μl甲醛)混合,65℃水浴15min。
(3)点样:同DNA的打点法。
(4)固定:同DNA的打点法。
(二)DNA的吸印转移法(Southern Blot)
DNA经过限制性内切酶消化和凝胶电泳后,放入碱性溶液中使其变性,将变性后的单链DNA从凝胶中按原来位置和顺序用滤纸吸印转移到硝酸纤维膜上,然后再与标记探针杂交。此方法比较准确地保持了特异DNA序列在电泳图谱中的位置,而且能测定分子量。
试剂:变性液:0.5mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCl
中和液:1mol/l Tris-HCl, 1.5mol/L NaCl pH8.0
20×SSC:0.3mol/L柠檬酸钠,3mol/l NaCl
1.电泳 取DNA约5μg加限制性内切酶进行酶切,电泳鉴定酶切完全后,取酶消化后的DNA点样于0.8%~1.2%的凝胶上,以0.8~1V/cm电压电泳过夜,在溴酚蓝离凝胶前缘0.5cm处停止电泳。将电泳后的凝胶翻转,紫外灯照射10~20min后拍照。
2.变性与中和 将电泳后的凝胶放入变性液中25℃振荡60min。蒸馏水洗胶1min,将凝胶放入中和液中25℃振荡60min。
3.转移 取托盘一只,放入10×SSC溶液约500~1000ml,托盘上搭一块比凝胶稍宽的长方形玻璃,取一长方形Wateman paper(滤纸)搭在桥上,两边浸入10×SSC溶液中,仔细去掉玻璃与滤纸之间的气泡(用玻棒在滤纸上滚动)。将凝胶放在滤纸上,去掉凝胶与滤纸之间的气泡。将硝酸纤维膜放入2×SSC溶液中浸湿后放在凝胶上(如NC膜浸湿不均匀,则考虑更换NC膜,操作时手切勿触及NC膜),去掉凝胶与NC膜之间的气泡。将一张滤纸(长和宽均比NC膜小1mm)放在NC膜上,仔细去掉气泡。将吸水纸切成与滤纸大小,重叠放在滤纸上,再压一重物约500~1000g。转膜24h,中间更换吸水纸。
图23-7 Southern转膜示意图
4.固定 用2×SSC溶液洗膜5min去掉残余凝胶,让膜自然凉干。将凝胶放入EB液中30min,取出在UV灯下观察是否有DNA残余。80℃烤膜2h,然后将膜封入塑料袋进行杂交。