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DNA重组技术及其在基因诊断中的应用
来源:医学全在线 更新:2007/12/3 字体:

  三、分子克隆化的另一些酶

  (一)DNA聚合酶

  (DNa polymerase)的作用是将1个脱氧三磷酸核苷酸加到引物(primer)的3’-OH上,释放出一个焦磷酸分子(ppi),如下式表示。

  聚合酶主要有以下几种:

  1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ  大肠杆菌DNA聚合酶(E.Coli DNA polymerase)主要有3种作用:①5’→3’的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA,填补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。②3’→5’的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。③5’→3’外切酶活性。切除受损伤的DNA。它在切口平移(nick translation)中的应用,将在下面介绍。

  大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完整的DNA聚合酶Ⅰ的一个片段,只有在5’→3聚合酶活性和3’→5’外切酶活性,失去了5’→3外切酶活性。它可用于填补DNA单链末端成为双链。如果供给32P标记的三磷酸核苷酸,则可使DNA带上同位素标记。当用交错切割的限制酶切成带有单链粘性末端的DNA片段,要用被切成平头末端的DNA片段连接时,可以先用Klenow片段使粘性末端的单链补齐成为平头,然后在DNA连接酶作用下把两个DNA片段连接起来。

  另外还有大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ。前者不能利用单链DNA或poly(dA-dT)为模板。需有镁离子和dNTP时才能表现出酶活性,无自发合成DNA的作用。后者没有5’→3外切酶活性,也不能用单链DNA作为模板。

  2.噬菌体DNA聚合酶  这里以T4DNA聚合酶为例。它也具有5’→3聚合酶活性,但它的外切酶活性比大肠杆菌的要高200倍。因此,它也可用来补齐单链末端或标记同位素。

  (二)RNA聚合酶

  RNA聚合酶(RNa polymerase)的作用是转录RNA。有的RNA聚合酶有比较复杂的亚基结构。如大肠杆菌RNA聚合酶有四条多肽链,另有一个促进新RNA分子合成的σ因子,因此它的组成的是α2ββσ。这种结构称为全酶(holoenzyme),除去了σ因子的酶称为核心酶。噬菌体RNA聚合酶则没有亚基。

  真核生物的RNA聚合酶分三类。RNA聚合酶Ⅰ存在于核仁中,转录rRNA顺序。RNA聚合酶Ⅱ存在于核质中,转录大多数基因,需要“TATA”框。RNA聚合酶Ⅲ存在于核质中,转录很少几种基因如tRNA基因如5SrRNA基因。有些重复顺序如Alu顺序可能也由这种酶转录。上面提到的“TATA”框又称Goldberg –Hogness顺序,是RNA聚合酶Ⅱ的接触点,是这种酶的转录单位所特有的。它在真核生物的转录基因的5’端一侧,在转录起点上游20至30个核苷酸之间有一段富含AT的顺序。如以转录起始点为0,则在-33到27个核苷酸与-27至21核苷酸之间,有一个“TATA”框。一般是7个核苷酸。RNA聚合酶Ⅱ转录单位的典型结构如图23-2。原核生物中也类似“TATA”框的结构。RNA聚合酶作用在“TATAAT”(Pribnow)盒和“TTGA-CA”框附近。

图23-2 反转录酶的作用机理

  (三)反转录酶

  反转录酶(Reverse transcripatase)是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA(cDNA)的酶。哺乳类C型病毒的反转录酶和鼠类B型病毒的反转录酶都是一条多肽链。鸟类RNA病毒的反转录酶则由两上亚基结构。真核生物中也都分离出具有不同结构的反转录酶。这种酶需要镁离子或锰离子作为辅助因子,当以mRNA为模板时,先合成单链DNA(ssDNA),再在反转录酶和DNA聚合酶Ⅰ作用下,以单链DNA为模板合成“发夹”型的双链DNA(dsDNA),再由核酸酶S1切成二条单链的双链DNA。因此,反转录酶可用来把任何基因的mRNA反转录成cDNA拷贝,然后可大量扩增插入载体后的cDNA。也可用来标记cDNA作为放射性的分子探针。

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