(4)头发
①拔下头发,剪下头发近端0.5cm段;
②置入0.4ml溶液2中(1.5ml管);
③按程序A5~7步进行,用50μl体系作PCR。
(5)血细胞RNA用焦碳酸二乙酯(DEP)抑制RNase,NP-40溶胞但不溶核。
①用聚蔗糖-泛影葡胺或其它方法分离单核细胞;
②置2ml离心管中,加PBS至细胞中,500×g离心5min;
③配制(DEP)溶液用无水乙醇将DEP作9+1稀释,再用NP-400.5%作1:999稀释(抑制RNase);
④细胞沉淀中加200~400μl此溶液,旋涡混合;
⑤13000×g离心10s;
⑥上清转移至新管中,37℃保温20min,90℃,10min;
⑦离心,上清转移至新管。取5~10μl作反转录;
⑧如果反转录失败,可能因DEP残留,可将样品再在90℃加热5min,再做试验;
⑨本法也可用于培养细胞。
二、注意事项
PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增,应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染,这是造成假阳性最大的可能。下例可形象说明污染的严重性。
典型的PCR反应可在100μl反应液中扩增1012个DNA,此液倾入50nm×25m×2m的游泳池中,充分混合取0.1ml池水,其中含有40个分子的DNA,用PCR扩增即已可呈阳性,这一点对检测HIV更为重要。常规只要15个拷贝的核酸即可查出。假阳性结果往往来自痕量污染和交叉污染,尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下,更有必要采取防备措施。
(1)DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上,所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理,常规消耗用品用后作一次性处理,避免反复使用造成污染。
(2)PCR在超净台内进行,操作前后紫外灯消毒。
超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品;移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器,防止移液器基部污染。
(3)PCR操作应戴手套并勤于更换。
(4)成套试剂,小量分装,专一保存,防止它用。配制试剂用新器具,用后作一次性处理。
(5)试剂管用前先瞬时离心(10s),使液体沉于管底,减少污染手套与加样器机会。
(6)最后加模板DNA(包括在石蜡油后),马上盖好,混匀,瞬时离心(10s),使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染,所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。
(7)实验设阳性、阴性对照。