一、PCR操作范例
在一个典型的PCR反应体系中需加入:适宜的缓冲液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg2+和两个合成的DNA引物。模板DNa 94℃变性1min,引物与模板40~60℃退火1min,72℃延伸2min。在首次循环前模板预变性3~5min;在末次循环后,样品仍需继续延伸3~5min以上,确保扩增的DNA为双链DNA。为便于了解PCR反应中各成份的组成,加入量和反应条件,使人们以此为基础,对不同的研究对象逐项改变来找到最佳反应条件,特列举Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA试剂盒提供的典型反应条件供参考。
表22-1 PCR反应混合液
成分 | 加入体积(μl) | 最终浓度 |
双蒸馏水 | 53.5 | |
10×反应缓冲液[1] | 10.0 | [1×]Mg2+1.5mmol/l K+50mmol/L |
4×dNTPs(各1.25mmol/L) | 16.0 | 各200μmol/L |
λ-DNA模板(全长48.5kD) | 10.0 | 1ng/次 |
引物1,2(各25bp,20μmol/L)[3,4] | 5.0 | 1.0μmol/L(100pmol) |
Taq聚合酶储存液[2] | 0.5 | 2U/100μl |
总体积(pH8.3) | 100.0 | |
石蜡油 | 50~100.0 |
扩增条件:94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25~30个循环。
注:[1]反应缓冲液[10×]含:100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃),
15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2,
0.01%(W/V)明胶(Sigma G2500)
[2]酶储存缓冲液(-20℃)含:50%甘油,100mmol/l KCl,
20mmol/L Tris-HCl ph8.0
0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT
200μg/ml明胶
0.5%吐温20,0.5% Nonidet P40
[3][4]引物,1,2:扩增λ-噬菌体基因中500bp的片段
引物1序列:7131~7155(5’)-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)
引物2序列:7606~7630(5’)-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)
注意(3’)端有2个bp互补故易生成50bp的双体
二、PCR反应系统的组成
(一)PCR缓冲液(PCr Buffer)
用于PCR的标准缓冲液见PCR操作范例。于72℃时,反应体系的pH值将下降1个单位,接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要,影响PCR的特异性和产量。实验表明,Mg2+优于Mn2+,而Ca2+无任何作用。
1.Mg2+浓度Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L(当各种dNTP浓度为200mmol/L时),但并非对任何一种模板与引物的结合都是最佳的。首次使用靶序列和引物结合时,都要把Mg2+浓度调到最佳,其浓度变化范围为1~10mmol/L。Mg2+过量易生成非特异性扩增产物,Mg2+不足易使产量降低。医学全在线www.med126.com
样品中存在的较高浓度的螯合剂如EDTA或高浓度带负电荷的离子基团如磷酸根,会与Mg2+结合而降低Mg2+有效浓度。因此,用作模板的DNA应溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。
dNTP含有磷酸根,其浓度变化将影响Mg2+的有效浓度。标准反应体系中4×dTNPs的总浓度为0.8mmol/L,低于1.5mmol/L的Mg2+浓度。因此,在高浓度DNA及dNTP条件时,必须相应调整Mg2+的浓度。
2.Tris -HCl缓冲液在PCR中使用10~50mmol/L的Tris –HCl缓冲液,很少使用其他类型的缓冲液。Tris缓冲液是一种双极化的离子缓冲液,pKa为8.3(20℃),△pKa为0.021/℃。因此,20mmol/l Tris pH8.3(20℃)时,在典型的热循环条件下,真正的pH值在7.8~6.8之间。
3.KCl浓度K+浓度在50mmol/L 时能促进引物退火。但现在的研究表明,NaCl浓度在50mmol/L时,KCl浓度高于50mmol/L将会抑制Taq酶的活性,少加或不加KCl对PCR结果没有太大影响。
4.明胶明胶和BSA或非离子型去垢剂具有稳定酶的作用。一般用量为100μg/ml,但现在的研究表明,加或不加都能得到良好和PCR结果,影响不大。
5.二甲基亚砜(DMSO) 在使用Klenow片段进行PCR时DMSO是有用的;加入10%DM-SO有利于减少DNA的二级结构,使(G+C)%含量高的模板易于完全变性,在反应体系中加入DMSO使PCR产物直接测序更易进行,但超过10%时会抑制Taq DNA聚合酶的活性,因此,大多数并不使用DMSO。