（四)外周血培养及染色体制片技术
1．国内应用的外周血培养染色体技术
（1)原理：外周血染色体制备是目前应用最广泛的细胞遗传学诊断技术，亦是基本的实验技术，由于取材容易，培养过程比较简单，短期内可以得到结果，所以其实用价值很高。
血液中含有红、白两类细胞，它们均是处于未分裂的间期细胞。红细胞没有核，无分裂能力；白细胞类虽有细胞核存在，但是外周血中处于休止期。植物血球凝集素（简称PHA)能促使淋巴细胞和单核细胞转化为具有分裂作用的母细胞。染色体只有在细胞分裂中期时最典型。秋水仙素类药的药物能抑制纺锤丝的形成，使细胞分裂停止于中期，低渗处理使细胞膨胀，细胞膜破裂，染色体分散，这样就可便于分析。
简意流程图：
（2)操作过程
①采血：无菌干针筒从静脉取血1～2ml，用肝素抗凝（约每毫升全血内含肝素100单位)。
②培养液配制：RPMI 1640 4ml
小牛血清 1ml
1%PHA（自制)0.2ml
调节 pH为7.4后置于-20℃冰箱
③标本接种：每5ml培养液加入抗凝全血0.5ml。
④培养细胞：将接种好的培养瓶置于37℃恒温箱中培养72h。
⑤阻止分裂：培养至68h，加秋水仙素，最终浓度0.02μl/ml，摇匀后置于37℃恒温箱中继续培养4h。
⑥收获：培养物混合后，置于10ml离心管内，离心10min（1000转/min)，去上清液。留下培养物。
⑦低渗处理：低渗液可用0.56%的KCl（或0.075mol/l KCl)5～7ml，用吸管打散沉淀物，置于37℃水浴箱中保温20min，然后加入固定液（3份甲醇：1份冰乙酸)1ml用吸管打匀，预固定1～2min。
⑧离心：1000转/min离心10min。
⑨固定：吸去上清液，留下沉淀加上述固定液6～8ml，用吸管将沉淀物打散，固定30min后离心，1000转/min离心10min，取出吸去上清液留下沉淀。
⑩重复上述固定离心1次。
⑾标本制作：最后1次固定、离心后吸去上清液，留下沉淀再加少量新鲜固定液约0.3ml打散细胞悬浮液即可进行制片。制片之前先将载玻片经清洁液洗净处理后，置于冰箱内制成冰片。取冰片1张滴上2～3滴细胞悬液。利用冰片的表面张力关系使液体迅速向玻片四周散开，与此同时用嘴轻轻吹向滴片处，以助其更快散开，然后在酒精灯火上通过7～8次后，自然干燥或烤干均可。医学.全.在线.网.站.提供
⑿染色：Giemsa染液1份和pH7.4磷酸缓冲液9份，混合后，染色20min，蒸馏水洗去余下染液，晾干，镜检观察。
（3)注意事项
①无菌操作是关键。培养液不得污染。
②所用药品不得失效，特别是PHA，既要使淋巴细胞转化，又不能过量。
③小牛血清优质、无菌。
④秋水仙清素低浓度4～6h效果最佳，过量则染色体易收缩。
⑤固定液和Giemsa染液要求新鲜配用。
⑥培养时间72h较好。
（4)各种物品清洗与消毒
①玻璃器皿用后，立即用自来水冲洗，再用洗衣粉刷洗，然后用自来水冲洗。待干，泡入清洁液24～48h，取出，自来水冲洗，再用双蒸水冲洗，干后备用。
②接触洗液时，带上橡皮手套，围裙等防护品。
常用清洁液配制：
重铬酸钾25g
水200ml
浓硫酸1000ml
③先将重铬酸钾在水中溶解，然后慢慢加入浓硫酸，边加边搅拌，防止过度发热。使用3～6月后检查，若变绿表示失效。
④G5、G6漏斗的处理：水洗净、晾干，于浓硫酸泡（或洗液中泡)24h，再用蒸馏水冲洗至加入1%BaCl2滴无白色沉淀为止。包装消毒，15磅20min。
（5)橡皮塞的处理
新的橡皮塞洗后，先用0.5N NaOH煮沸15min，再用0.5n HCl煮沸15min，流水冲洗10min，用双蒸水泡24h，双蒸水冲洗，晾干，15磅20min高压灭菌。
（6)金属器械清洗
先用纱布或纸擦去防锈油，然后用洗涤液清洗，再用清水或蒸馏水洗净，擦干或烘干备用。
2．外周血细胞培养法（Bhatt B and McGee JOD,1990)
（1)收集静脉血（无菌)，加肝素抗凝（20单位/ml)；
（2)加0.8ml全血入每个培养瓶（含10ml培养液)，37℃培养72h；
培养液配制：RPMI 76ml(Gibco,Cat.No.041-1875M)
小牛血清 20ml
PHA 2.0ml
（3)加100μl Brdu于培养瓶中，37℃再孵育16～17h；
（4)离心（1200rpm)8min，弃去上清液，沉淀中加入10ml RPMI 1640培养液，混匀；
（5)重复步骤（4)；
（6)沉淀中加入10ml新配制的完全培养液（含2.5μg/ml胸腺嘧啶)，重新置于37℃孵育6～7h；
（7)在收获培养细胞前15～30min，可加Colcemid,但当同时应用BrdU时这就并非十分必要。因为BrdU是胸腺嘧啶核苷的类似物，能使染色体在富含异染色质处断裂分解，从而使显带明显；
（8)1200rpm离心培养细胞，弃去上清液，加入1ml 0.56% KCl（事先预热至37℃)，继续加入0.56%KCl使总容量达到10ml，在37℃孵育10min；
（9)如上述离心，弃去上清液，在沉淀的细胞内加入新鲜的冷固定剂，（甲醇：冰醋酸=3：1，新鲜配制，保存在冰上)，置冰上至少20min；
（10)重复步骤（9)3～4次，直至细胞悬液清洁无色；
（11)可较长期保存在冰的固定剂内（-20℃)或再离心后加入0.5～1.0ml新鲜固定剂，置于冰上；
（12)玻璃载片放在Decon（清洁液)或其它的清洁液内过夜，次日用自来水冲洗，继之蒸馏水漂洗，在60～75℃干燥，然后把载片孵育在2%丙酮液内，室温，60min。自来水冲洗，再在60～75℃干燥；
（13)每张载片上加10μl的细胞混悬液，空气干燥，在24h后可应用于杂交实验，也可保存在-4℃达8周之久（试剂配制法见附录四)。
