当胸腔穿刺抽出的胸液细胞学检查并不能明确诊断时，则行胸膜针刺活检；通常用于怀疑结核，肉芽肿性感染或恶性肿瘤造成的渗出性胸腔积液患者。胸膜活检的诊断阳性率取决于积液的病因。结核患者，胸膜活检比胸腔穿刺和单独胸液培养更敏感，80%患者首次活检可确诊，10%以上的患者需第二次活检确诊。胸膜恶性病变患者，90%经胸液细胞学加上胸膜针刺活检确诊。禁忌证与胸腔穿刺术一样(见上文)。

术前用药，准备和麻醉与胸腔穿刺术一样。特别设计用于皮下胸膜活检的活检针包括Abrams，Cope和Tru-Cut针。在皮肤和皮下组织做一小切口，连有针筒的活检针经由下根肋骨的上缘进入胸液中。针体的切割腔打开，通过侧向或向下的针压，壁层胸膜被钩至切割腔槽口处。关闭切割腔，切取其中的胸膜片。组织可吸至相连的针筒内或将针退出后回收。至少需要经同一皮肤位置将针的切割腔分别置于3点，6点，9点钟处取材3块行组织学检查和培养。为避免损伤上面的肋下神经血管束，术者千万不要把切割腔朝上打开活检。胸膜活检必须行胸部X线检查。

并发症同胸腔穿刺术，但气胸和出血的发生率略高。