主权项
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一种筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法,该方法的步骤为:A:将蛋白质组样品经过丙酮预处理以降低杂质含量;B:将处理过的样品在非变性条件下进行等电聚焦IEF,IEF之后从凝胶上切下两根宽度相同的IEF胶条,在缓冲液A中平衡后进行第二向的聚丙烯酰胺凝胶电泳,使用丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺制备非变性凝胶,上槽缓冲液的组分为Tris-base,Tricine和SDS,恒压电泳至溴酚蓝前缘到达底部;C:将PAGE所得的两块胶分别处理,一块胶用考马斯亮蓝CBB染色,脱色后用做备份,另一块胶则经电印迹,将蛋白质斑点转移到NC膜上,使用不含SDS的缓冲液A;D:经过0.01~0.2MTris-Cl,pH=7.5的缓冲液漂洗除去SDS,将NC膜真空干燥;E:在NC膜上均匀地分布细菌,使其密度达到1×103~1×105CFU/mm2后,将膜置于牛肉膏固体培养基上培养,该培养基含显色剂;同时含有细菌生长所需的底物,该底物经细菌代谢能产生酸性产物;在NC膜上正常生长的细菌由于其代谢产物呈酸性因而在其周围呈亮黄色,而有抗菌肽斑点的地方细菌生长受抑制,故而和周围呈现出色差,为暗色的斑点;F:将NC膜上的斑点与双向电泳所得到的凝胶上的斑点相对照,将凝胶上对应于NC膜上抗菌肽色斑的斑点切下,然后对这些斑点用质谱指纹图,N端序列分析,氨基酸组成分析进行微量鉴定。
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