原位杂交组化（ISHH)与免疫组织化学（IHC)结合法是先后用ISHH和IHC在同一切片或两个相邻切片进行染色，这样就可以同一细胞中显示出某种mRNA和相应的蛋白、多肽或其它抗原，从而可更好地了解某一基因www.lindalemus.com/zhuyuan/的转录和蛋白、多肽合成的动力学。ISHH与IHC结合法可以在相邻切片上分别进行ISHH和IHC染色，也可先后在同一切片上进行ISHH和IHC染色。前者可使ISHH和IHC染色都获得理想的结果，易成功，但易产生空间误差和样本误差。在同一切片上进行结合法可克服这些误差，但第一次染色总要或多或少地影响第二次染色，使第二次染色不十分理想。由于m RNA易被染色过程中污染有少量RNase的液体所降解，因而在实践中往往首先进行原位杂交组化染色，这种次序使结合法易成功。但在操作方法中应注意减少生物活性肽或蛋白的丢失，如在杂交后冲洗中适当减低漂洗温度。

一、同位素原位杂交组化与免疫组化PAP法的联合程序

（1)切片入PBS冲洗5min，最好是将切片漂洗于灭菌器皿中。

（2)0.1mol/L 甘氨酸PBs 5min。

（3)0.4%Triton X-100 PBS 15min。

（4)1μg/ml蛋白酶K，37℃保温30min。

（5)4%多聚甲醛PBS固定5min 。

（6)PBS冲洗2×3min。

（7)0.25%乙酸酐（0.1mol/L 三乙醇胺配)10min。

（8)2×SSC冲洗10min。

（9)杂交：如是cDNA探针用前需进行变性处理，载片法时将切片在空气中晾干，加含探针的杂交液10μl于切片上，盖上22×22mm的硅化盖片或相当大小看蜡膜，³H标记探针每10μl杂交液含1×10⁵cpm探针，³²P或³⁵S标记探针每10μl杂交液含5×10⁵cpm探针；如是漂浮切片，则用灭菌吸水纸将切片水份尽量吸干，然后入杂交液，探针浓度和载片法一样。入杂交液后43℃保温12～16h。

（10)4×SSc 37℃冲洗10～30min。

（11)2×SSC（如为RNA探针则含20μg/ml RNase)37℃冲洗30min。

（12)1×SSC和0.1×SSc 37℃分别冲洗30min。

（13)PBS冲洗2×5min。（转录ISHH)

（14)0.5%H₂O₂PBS室温30min。

（15)1%BSA 37℃，30min 。

（16)第一抗体，4℃孵育16～24h。

（17)PBS冲洗4×5min。

（18)第二抗体37℃，1h。

（19)PBS冲洗3×5min。

（20)兔PAp 37℃，1h 。

（21)PBS冲洗3×5min。

（22)DAB显色液5～10min（DAB显色液：0.05%DAB + 0.03% H₂O₂PBS液配)。

（23)PBS冲洗3×5min。如是漂浮切片则将其贴于涂有粘附剂的载片上，晾干。

（24)切片入70%，85%，95%和2个100%酒精脱水，空气干燥。

（25)在暗室涂布乳胶（乳胶配制：乳胶原液：0.6mol/L醋酸胺=1：1)，晾干，装入自显影暗盒。

（26)4℃曝光：³H标记探针4～8周，³⁵S标记探针1～4周，³²P标记探针7～10天。

（27)D₁₉₆显影液，20℃显影5～10min。

（28)自来水冲洗数秒。

（29)F₅坚膜定影液10min。

（30)自来水冲洗15min。

（31)切片温箱烤干，脱水，透明，封片。

结果：蛋白或多肽免疫反应阳性细胞为棕色胞质，而其相应mRNA为黑色银颗粒聚集。

二、非同位素原位杂交组化与免疫组化联合法

非同位素标记物很多例如：生物素（biotin)，地高辛（Digoxigenin)，汞（mercury)，溴（bromine)和碱性磷酸酶等，其中目前应用最多的是生物素和地高辛。将此法与免疫组化PAP法或ABC法联合使用，能成功地显示一些神经肽mRNA和神经肽的共存与共同分布。向正华等发现碱性磷酸酶抗地高辛抗体是经木瓜蛋白酶处理的，只有抗体的Fab段没有Fc段，而免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC)所应用的抗体既有Fab段，又有Fc段。由于抗体的这一特性可在ISHH和ICC抗体孵育时将检测核酸的抗地高辛抗体Fab段与检测蛋白、多肽的兔抗血清混合在一起，一同孵育切片，这样可明显缩短ISHH和ICC结合法的实验周期，同时还可以减少实验过程中对ICC检测的蛋白、多肽的损害，使结合法易成功。为什么两种抗体可同时混合孵育切片，这是因为抗地高辛抗体只有Fab段，而没有Fc段。我们知道抗体的抗原决定簇在Fc段，因此第二抗体与第一抗体的结合是第二抗体的Fab与第一抗体的Fc，所以第一抗体如果只有Fab段没有Fc段，那么第二抗体就无法与一抗结合。因此实验中将二种抗体混合孵育切片而不会产生交叉结合。以下为此法的原理图（图20-5)。

图20-5　原位杂交细胞化学与免疫细胞化学结合法

此种ISHH与ICC联合法稳定，实验周期短，蓝色与棕色反差强，是目前较好的ISHH与ICC结合法。详细程序如下：

（1)将切片漂浮于能经受高压灭菌的器皿中。0.1mol/l PBS pH7.2冲洗3×5min。

（2)0.1mol/L甘氨酸PBS冲洗5min。

（3)0.4% Triton X-100 PBS 15min。

（4)1μg./ml蛋白酶K（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA 配)，37℃保温30min。

（5)4%多聚甲醛PBs 5min。

（6)PBS冲洗2×min。

（7)0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配)10min。

（8)2×SSC冲洗10min。

（9)将切片用灭菌吸水纸吸干，然后入杂交液。核酸探针浓度为0.25～0.5μg./ml。每一正常成年大鼠脑冠状切片15μl杂交液足够。43℃保温12～16h。

（10)4×SSc 37℃冲洗30min。

（11)2×SSC（含RNasea 20μg/ml)37℃保温30min。

（12)1×SSC和0.5×SSc 37℃分别冲洗30min。

（13)0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

（14)0.5%H₂O₂PBS室温20min。

（15)0.05mol/l PBS 冲洗2×5min。

（16)碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体（Fab)与抗蛋白或多肽等抗体混合液，前者一般1：1000稀释，后者则因抗体而异。稀释液：1%BSA，0.4%Triton X-100 ,0.05mol/L PBSpH7.2，4℃孵育24h。

（17)0.05mol/l PBS冲洗4×5min。

（18)二抗（1：100～1：200)37℃保温1h。

（19)0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

（20)PAP（1：200～1：400)37℃保温1h。

（21)0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

（22)DAB显色液（0.05%DAB + 0.03% H₂O₂,0.05mol/L PBS pH7.2配)显色5～10min。

（23)0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

（24)TSM，冲洗2×5min（TSM₁：0.1mol/l Tris –www.lindalemus.com/wsj/ HCl pH8.0,0.1mol/LNaCl,0.01mol/L MgCl₂).

（25)硝基四氮唑蓝（400μg/ml)和5-溴-4-3-吲哚磷酸（200μg/ml)混合液（TSM₂配显色混合液)显色1～3h，避光。

（26)20mmol/l EDTA终止显色。

（27)将切片贴于涂有铬矾明胶的载片上，空气干燥。

（28)梯度酒精脱水，透明、封片。

结果：ISHH阳性细胞的胞质呈紫蓝色，胞核不着色，示该细胞含XmRNA。ICC阳性细胞的胞质呈棕色，胞核不着色示该细胞含X多肽。双标记细胞的胞质为蓝棕混合色，示多肽与mR－NA共存于该细胞内。