［摘要］ 目的：研究苦参素对成纤维细胞增殖、形态学及转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响，阐明其抗肝纤维化的作用机制。方法：用甲基噻唑基四唑MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)比色法、HE染色及免疫细胞化学技术分别检测小鼠皮肤成纤维细胞(NIH3T3)增殖、形态学及TGF-β1的表达。结果：苦参素能明显抑制成纤维细胞增殖及TGF-β1的表达，并呈剂量依赖性。结论：苦参素可通过抑制成纤维细胞增殖及TGF-β1的表达而起到抗肝纤维化作用。
Affect of kwoninone on fibroblastic proliferation, morphology and expression of TGF-β1
［ABSTRACT］ AIM:To study the affect of kwoninone on fibroblastic proliferation, morphology and expression of transforming growth factor-beta (TGF-β1) and elucidate its mechanism in fibrosis. METHODS: The proliferation, morphology and expression of TGF-β1 of fibroblast was measured by MTT bioassay, HE dyeing and immunocytochemistry. RESULTS: The kwoninone has an could significantly inhibit fibroblastic proliferation, growth and expression of TGF-β1 in concentration-dependent manner. CONCLUSION: The kwoninone anti-hepatic fibrosis effect through inhibiting fibroblastic proliferation, growth, and expression of TGF-β1.
［KEY WORDS］ kwoninone; fibroblasts; transforming growth factor beta; sophora subprastrata
苦参素(k woninone)，是从中药广豆根(Sophora Subpsostarata)中分离所得生物碱类，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抑制免疫、抗肿瘤等生物学作用［1］。近来有研究报道，用它治疗慢性肝炎，可有效的降低ALT、改善临床症状、并使乙型肝炎及丙型肝炎病毒标志物转阴、减轻炎性细胞浸润及肝细胞坏死，另具有防治肝纤维化作用［2-4］。本研究以小鼠皮肤成纤维母细胞(NIH3T3)为靶细胞，从细胞及细胞因子水平研究苦参素对成纤维细胞增殖、生长及转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响，以期从细胞及细胞因子水平阐述苦参素抗肝纤维化作用机制，为临床用于肝纤维化的防治提供更多的理论基础。
材料与仪器 靶细胞：NIH3T3细胞株(购于中国科学院上海细胞所)。苦参素注射液(2 mL:200 mg，批号980215，上海第一生化药业公司)，RPMI1640培养基、小牛血清、胰酶、甲基噻唑基四唑(MTT，华舜生物试剂公司)，二甲基亚砜(DMSO)，苏木精染液，伊红染液；TGF-β1免疫组织化学染色试剂盒，DAB显色试剂盒。B5060EX二氧化碳培养箱(德国Heraeus公司产品)，37XAZ倒置生物显微镜(上海光学仪器厂)，Olympus光学显微镜，DG-3022型酶联免疫检测仪(南京华东电子管厂)，YS-875A净化工作台。
方法
1 MTT法检测不同浓度的苦参素对NIH3T3细胞增殖的影响 用0.25%胰蛋白酶消化单层培养NIH3T3细胞，用含10%的小牛血清RPMI1640培养液稀释为单个细胞悬液(5×107个·L-1)，接种于96孔培养板，每孔100 μL，同时每孔加入经培养液倍比稀释的苦参素100 μL，至苦参素终浓度分别为31.3，62.5，125，250，500，1000 mg·L-1，每种浓度设3个复孔；并设对照孔3个，不加苦参素，而加入等量的培养液；另设空白对照孔3个，不加细胞，其他条件与前相同。同时，在相同条件下用同样方法再接种另2块96孔培养板。将培养板移入CO2孵箱中，培养48 h后，每孔加入MTT溶液(5 g·L-1，PBS)20 μL，37 ℃继续孵育4 h，终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上，选择490 nm波长，以空白对照孔调零，检测各孔光吸收值，将所得结果进行统计学分析。
2 苦参素对成纤维细胞形态学及TGF-β1的影响 制细胞爬片：将生长良好的NIH3T3细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，调整细胞密度为1×108个·L-1，接种于含盖玻片的2块培养皿中，其中一块加入苦参素使终浓度为500 mg·L-1，另一块加入等量的培养液，放入CO2孵箱培养2～3 d，待细胞基本长成单层，取出盖玻片，95%乙醇固定。HE染色；TGF-β1免疫细胞化学染色：将经苦参素处理和未处理的细胞爬片各一块，滴加适当稀释的一抗(小鼠TGF-β1单抗)，37 ℃孵育1.5 h，0.01 mol·L-1的PBS洗2 min，2次；滴加山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育15 min，0.01 mol·L-1的PBS洗2 min，2次；滴加试剂APA-兔抗山羊IgG,37 ℃，20 min, 0.01 mol·L-1PBS洗5 min，4次。DAB显色：使用DAB显色试剂盒，取1 mL蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片，室温显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤。苏木素轻度复染，脱水、透明、封片，显微镜观察，照相保留结果。
3 统计学方法 t检验，P＜0.05为有显著意义。
结果
1 苦参素对NIH3T3细胞增殖的影响 不同浓度的苦参素作用于NIH3T3细胞48 h后，平均每孔的吸光度如表1所示，当苦参素浓度达到62.5 mg·L-1时，NIH3T3细胞增殖活性受到明显抑制(P＜0.05)，并呈剂量依赖性。
表1 MTT法检测苦参素对NI H3T3细胞增殖
的影响(n=9,±s)
组别 浓度/mg·L-1 吸收度(OD)
对照 0 0.447±0.013
1 31.3 0.431±0.020a
2 62.5 0.338±0.014b
3 125 0.272±0.016c
4 250 0.221±0.019ce
5 500 0.199±0.021c
6 1000 0.179±0.020ce
各组与对照组比较经t检验：aP＞0.05,bP＜0.05,cP＜0.01;4,6与2组间比较经t检验：eP＜0.05。
2 苦参素对NIH3T3细胞形态学的影响 对照组细胞胞体较大，胞浆丰富，胞突多，呈多角型，胞核大，处于核分裂期细胞多。苦参素处理组NIH3T3细胞胞体较小，胞突少，多呈梭型或圆形，胞核较小，处于核分裂期细胞较少。如图1所示：
3 苦参素对成纤维细胞TGF-β1表达的影响 经TGF-β1免疫细胞化学法染色，在显微镜下可以观察到，苦参素处理组成纤维细胞胞浆内棕黄色颗粒弱、量少，呈弱阳性；而正常对照组成纤维细胞胞浆内呈强阳性，这说明苦参素能抑制成纤维细胞TGF-β1的表达。结果如图2所示：
讨论 肝纤维化发生的主要机制是肝细胞外基质(ECM)的过度增多和异常沉积，这一过程是不断变化的，重要的是肝脏多种细胞(如贮脂细胞)产生细胞外基质，而后者又反过来影响细胞的发生、分化、增殖、粘附和表型的表达，这种相互作用又是由多种细胞因子介导的。近年研究表明，贮脂细胞是肝纤维化细胞外基质的主要来源细胞［5］，在肝损伤时，贮脂细胞能合成除V型胶原外的几乎所有的ECM成分，肝细胞坏死的刺激能激活贮脂细胞并使之增殖，贮脂细胞增殖后表型发生改变，显著的表型变化使之转变为肌纤维母细胞(myofibroblasts)和成纤维细胞，后者是产生ECM的主要细胞，对肝纤维化的形成起主要作用［6］。
近年研究也表明TGF-β1是促进肝纤维化形成的一重要细胞因子，肝纤维化时，门脉周围细胞、导管周围细胞、肝小叶中央静脉周围细胞与肝包膜间质细胞等部位TGF-β1mRNA转录明显增加［7］。TGF-β1的突出作用是促进胶原与基质的形成，同时抑制其降解。它还能促进贮脂细胞向肌成纤维细胞样细胞的转化，促进肝细胞的增殖；还可增加纤连蛋白(FN)及蛋白多糖(PG)的合成，并促进FN和胶原在细胞外基质中的沉积；此外TGF-β1还通过抑制胶原酶和蛋白酶的产生，以及促进组织抑制因子(如金属蛋白酶，α2巨球蛋白等前纤维蛋白溶酶抑制物)的分泌，来减少胶原的降解［8］。有研究表明肝纤维化时，肝脏间质细胞如贮脂细胞、内皮细胞、库普弗细胞(昔名枯否氏细胞)等通过自分泌或旁分泌TGF-β，调节贮脂细胞及肝细胞等合成细胞外基质，促进肝纤维化形成［9，10］。
本实验以肝纤维化研究常用的模型细胞NIH3T3(小鼠皮肤成纤维母细胞)为靶细胞，研究苦参素对成纤维细胞增殖、形态学及TGF-β1表达的影响，结果发现苦参素能抑制NIH3T3成纤维母细胞的增殖，并且呈剂量依赖性，同时受抑制的NIH3T3细胞胞体较小，处于核分裂期细胞较少；NIH3T3细胞表达TGF-β1减少。提示苦参素可通过抑制肝纤维化时细胞外基质的主要来源细胞(成纤维细胞)的增殖、生长及TGF-β1的表达，而起到抗肝纤维化作用。它也有可能阻止肝纤维化时贮脂细胞的活化和增殖，这仍需进一步的研究证实，以阐明苦参素抗肝纤维化的机制。
［参考文献］(［REFERENCES］
［1］ 李 丹(Li D)，王平全(Wang PQ)，张楠森(Zhang NS).苦参碱类生物碱的研究进展及临床应用［J］.中草药(Chin Trad Herb&nbs p;Drugs)，1996，27：308-311.
［2］ 蔡 雄(Cai X)，王国俊(Wang GJ)，瞿 瑶(Qu Y)，樊成辉(Fan CH)，张瑞祺(Zhang RQ)，徐文胜(Xu WS).苦参素注射液治疗慢性乙型肝炎临床疗效分析［J］. 第二军医大学学报(Acad J Second Mil Med Univ)，1997，18：47-49.
［3］ 李继强(Li JQ)， 李超群(Li CQ)，曾民德(Zeng MD)，等(et al).氧化苦参碱治疗慢性丙型病毒性肝炎的初步研究［J］. 中国中西医结合杂志(Chin J Integrated Tradit Chin West Med)，1998，18：227-229.
［4］ 陈伟忠(Chen WZ)，张俊平(Zhang JP)，许 青(Xu Q)，等(et al).苦参碱对大鼠实验性肝纤维化的影响［J］. 第二军医大学学报(Acad J Second Mil Med Univ),1996，17：424-426.
［5］ 高春芳(Gao CF)，孔宪涛(Kong XT).肝贮脂细胞与肝纤维化［J］. 临床肝胆病杂志(Chin J Clin Hepatol)，1994，10：125-128.
［6］ Bissell DM. Lipocyte activation and hepatic fibrosis［J］. Gastroenterol,1992,102:1803-1805.
［7］ Krull NB, Zimmermann T, Gressner AM. Spatial and temporal patterns of gene expression for the proteoglycans biglycan and decorin and for transforming growth factor-β1 revealted by in situ hybridization during experimentally induced liver fibrosis in the rat［J］. Hepatology,1993,18:581-589.
［8］ Bedossa P, Paradis V. Transforming growth factor-β(TGF-β):A key-role in liver fibrogenesis［J］. Hepatol,1995,22 Suppl 2:37-42.
［9］ Friedman SL. The cellular basis of hepatic fibrosis［J］. N Engl J Med,1993,328:1828-1835.
［10］ Biagini G, Ballardini G . Liver fibrosis and extracellular matrix［J］. J Hepatol,1989,8:115-119.
