关键词： 树脂吸附 胆酸 动物实验
ANIMAL EXPERIMENTAL STUDY ON EFFECT OF RESIN
ADSORPTION ON DECREASE OF CHOLIC ACID
Key words: Resin adsorption; Cholic acid; Animal experiment
高胆汁酸血症出现于多种肝脏疾病。几乎在所有肝胆疾病中，急性病变的胆汁酸异常率高达100%，慢性病变的肝胆疾病血清胆汁酸异常达92%。当胆酸迅速上升超过肾脏的排泄功能，病人就出现了高胆酸血症，及其伴随症状搔痒。胆汁酸含量过高对机体有极大的危害性，它不仅会引起机体一系列的中毒症状，而且由于血液中包括胆汁酸在内的多种代射毒性物质的积聚会进一步加剧肝脏损伤。对此常规治疗方法几乎无效［1］，为改善病人的生存质量，为可施行的肝脏移植做准备，促进肝衰竭的自发性恢复，改善肝功能，减轻肝脏损害并利其再生，血液灌流吸附清除这些中分子脂溶性物质是一种有效的治疗方法［2，3］。
针对国内血液净化清除血液中高胆汁酸的研究空白，结合国内外研究资料，本实验选用新型高效NK-111系列树脂，对黄疸动物模型血液中胆酸进行吸附，探讨对胆酸盐的吸附及血液相容性，为临床血液灌流治疗高胆汁酸血症提供了最直接的依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1 生理犬：体重14～16kg,雌雄不限。
2 NK-111系列树脂：南开大学分子生物学研究所提供，非离子型吸附树脂体外模拟液吸附胆酸90%以上者。
3 仪器设备：Beckman332高效液相仪，HITACH835氨基酸分析仪，Cobas Mira自动生化仪，NIP BP-1血泵，聚四氟乙烯灌流柱(自制)，动、静脉血液管路等。
1.2 方法
1 模型准备：采用分流型黄疸模型，动物手术前晚禁食不禁水。肌注氯胺酮0.2g，静脉给予适量异戊巴比妥及适量安定，总量不超30mg，术后24h，动物出现精神萎糜，尿色明显加深，术后48h，血液胆酸浓度明显上升。
2 树脂准备：取树脂100ml,以70%乙醇浸取过夜，去离子水冲洗后，生理盐水置换，装入自制的聚四氟乙烯吸附罐内，两端以60目滤网封装，加压确认无渗漏后，常规高压蒸汽灭菌待用。
3 血液灌流吸附实验：模型手术后观察，待出现黄疸症状，行血液灌流，肌注氯胺酮0.2g，采用股动、静脉插管形成灌流回路。生理盐水充分冲洗管路及吸附罐，肝素盐水预充盈管路，连接动、静脉插管，以100ml/min的速度进行血液灌流吸附，吸附60min，定时于动脉插管远端采血。通过前肢静脉60min补液300ml。全部实验组动物在整个吸附过程中未出现出血及管路凝血现象。
4 测试方法：胆酸分析采用Sep-PAK富集方法经HPLL分析［4］，标准品为Sigma公司产品；氨基酸分析采用HITACHI835型分析仪；Cobas Mira全自动生化分析仪分析肝功能；凝血酶原时间采用一步法药合，Sysemx F800血细胞计数仪分析全血细胞。
2 结果与讨论
2.1 灌流吸附前后血清中胆酸含量的变化
用HPLC方法分析检测血液中7种胆酸的含量：牛磺胆酸(TCA)，甘氨胆酸(GCA)，牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，牛磺脱氧胆酸(TDCA)，甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，甘氨脱氧胆酸(GDCA)，牛磺石胆酸(TLCA)。
表1 树脂吸附前后血中胆酸含量变化 (μmol/L, n=12)
| 时间 | 0 | 15 | 30 | 45 | 60 |
| JC | 2.838±2.750 | 1.469±1.049 | 1.399±0.825 | 1.243±1.103 | 0.708±0.568 |
| GC | 6.337±6.250 | 3.099±2.829 | 2.647±2.325 | 1.697±1.419 | 1.412±1.422 |
| TCDC | 2.843±2.130 | 2.560±2.110 | 0.899±0.754 | 1.803±1.068 | 0.606±0.417 |
| TDC | 3.198±2.641 | 2.322±2.526 | 1.173±1.322 | 0.704±0.537 | 0.549±0.998 |
| GCDC | 4.825±2.225 | 2.286±1.530 | 1.527±1.168 | 0.597±0.497 | 0.322±0.290 |
| GDC | 4.322±4.362 | 3.236±3.305 | 2.000±1.536 | 1.063±1.176 | 0.325±0.333 |
| TLC | 2.350±2.369 | 2.259±2.424 | 0.949±0.512 | 0.916±1.114 | 0.230±0.215 |
7种结合胆酸变化情况：TC，GC，TCDC，TLC 4种胆酸起始浓度与终末比较显著下降；TDC，GDC两种胆酸起始浓度与45min浓度相比显著下降；GCDC的变化15min起即有明显下降。
动物实验表明胆酸的吸附与体外实验比较，NK-111树脂在动物模型吸附过程中的吸附能力有所下降，这一点与体内高胆酸蓄积以及吸附过程中胆酸仍不断产生有关。胆酸的产生、蓄积与吸附这三者之间存在着一种动态平衡。因此，是否可以认为在体内肝毒性物质的蓄积较低的情况下及早进行血液净化对临床症状的改善更为有利。
7种结合胆酸在经NK-111系列树脂吸附后平均下降率为62.5%。其中TC下降率47.5%，GC下降率53.6%，TCDC下降率52.7%，GCDC下降率76%，TDC下降率63.7%，TLC下降率74.5%，同国外吸附剂比较总胆酸吸附率高于国外剂型［5］。2.2 血清蛋白在吸附前后的变化
经NK-111系列树脂血液吸附1h后血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白的数量与吸附开始时比较无显著性差异，P＞0.05，见表2。
表2 血清蛋白在血液灌流前后的变化
| 起始 | 半程 | 终末 | P | |
| TP (g/l) | 60.00±14.5 | 55.60±9.98 | 52.35±4.80 | ＞0.05 |
| ALP (g/l) | 28.68±5.86 | 28.25±3.87 | 30.7±13.9 | ＞0.05 |
| GL (g/l) | 31.7±9.13 | 28.75±8.03 | 25.59±3.18 | ＞0.05 |
2.3 血液灌流前后全血细胞计数的变化
全血细胞吸附前后的变化见表3。
表3 血细胞计数在血液灌流过程中的变化
| 红细胞(×103/L) | 血小板(×109/L) | 白细胞(×109/L) | |
| 0 | 5.54±1.58 | 55.1±13.1 | 13.05±5.20 |
| 30 | 5.93±1.68 | 46.2±16.1 | 11.20±5.30 |
| 60 | 5.73±1.47 | 49.2±19.4 | 9.41±6.12 |
实验表明经包膜处理的NK-111系列树脂血液吸附后，红细胞数在吸附前后无显著性差异(P＞0.05)，血小板数与白细胞数有所下降，但不具备统计学意义(P＞0.05)。凝血酶原时间延长不超过50%。实验中未出现血清蛋白的损失，从表2可以看出，NK-111系列树脂对蛋白的吸附量很少，血液灌流1h，总蛋白下降12%。
树脂对全血细胞有一定的破坏性，血液灌流1h以后，血小板下降10%，白细胞下降约27%，但统计数据仍不显著(P＞0.05)。
NK-111系列树脂经采用特殊方法包膜处理以后，对血小板等的破坏减轻了，表现出较好的血液相容性。2.4 血液灌流前后的氨基酸变化
我们对正常生理犬氨基酸分析得到健康成年犬血清氨基酸数值见表4。
表4 正常生理犬氨基酸分析结果(n=6,μmol/L)
| 缬氨酸 | 163.3±41.0 | 赖氨酸 | 223.60±123.5 |
| 亮氨酸 | 49.27±19.77 | 酪氨酸 | 44.62±16.23 |
| 异亮氨酸 | 94.40±39.2 | 苯丙氨酸 | 67.70±42.6 |
| 苏氨酸 | 498.00±24.8 | 鸟氨酸 | 47.47±18.27 |
| 甘氨酸 | 177.60±78.6 | 组氨酸 | 78.70±31.7 |
| 丙氨酸 | 499.40±210.7 | 精氨酸 | 104.00±58 |
| 胱氨酸 | 34.55±8.55 | 脯氨酸 | 132.10±61.0 |
| 蛋氨酸 | 33.45±17.31 |
血液灌流1h后血浆氨基酸水平出现了一些变化，见表5所示。
表5 血液灌流前后黄疸犬血中某些氨基酸的变化(n=6 μmol/L)
| 吸附开始 | 吸附终末 | ||
| 赖氨酸 | 273.8±89.7 | 446.3±68.3 | P＜0.05 |
| 缬氨酸 | 260.5±67.9 | 310.9±62.0 | P＜0.001 |
| 异亮氨酸 | 80.1±29.6 | 137.3±34.3 | P＜0.001 |
| 亮氨酸 | 220.6±59.3 | 304.7±83.2 | P＜0.001 |
| 酪氨酸 | 45.1±12.9 | 43.9±16.3 | P＞0.05 |
| 苯丙氨酸 | 118.5±51.6 | 146.0±16.6 | P＜0.05 |
从表中可以看出经1h血液灌流，血中赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸水平都有明显升高，酪氨酸水平与生理状态及吸附开始时比较均无显著性差异。
本组实验表明采用NK-111系列树脂对黄疸犬血液灌流吸附胆酸获得了预期的结果。NK-111系列树脂对胆酸具有较高的吸附能力和较好的血液相容性，尤其对血小板的破坏很小，因此我们认为其作为一种辅助性人工肝及肝移植的“桥梁”在临床上有广泛的应用前景［5，6］。
参考文献
［1］ Bernhard H, et al. Removal of bile acid and billirubin by plasma perfusion of USP chaocal-coating glass. J Lab Clin Med 1979,94:585
［2］ Minto M, et al. Hapatic assist: present and future. Artif Org 1986, 10:214
［3］ Tang DH, et al. Temperature effect on bilirubin adsorption with the anion exchange resin BR-601. Int J Artif Organs 1989,12:659
［4］ 刘树业等.肝病患者血清与胆汁中7种结合胆酸的高效液相色谱分析.中华医学检验杂志，1993，16：152
［5］ Ji-chang S, et al. Investigation of bilirubin removol by NK-110 resin hemoperfusion in jaundice dogs. Int J Art Org 1986,9:327
［6］ Nose Y. Artificial Liver for a bridge to Liver transplanation. Art Org 1989,13:415
