摘 要 目的：在老年性痴呆的发病中，年龄是最主要的危险因素，随年龄增长，发病率显著增高，自然衰老大鼠模型是比较接近老年性痴呆病理改变的动物模型。我们以往的实验证明：中药复方962胶囊(含何首乌、石葛蒲等六味中药)能显著改善老年大鼠学习记忆功能。本研究观察中药复方962胶囊对自然衰老大鼠模型海马CAI—CA4区神经生长因子(NGF)及其受体TrK A表达的影响，探讨中药复方962胶囊治疗改善学习记忆功能的作用机理。方法：雌性Wistar大鼠老年为22月龄，青年为5月龄。阳性对照药为脑复康(piracetam)0.56g/kg，中药复方962胶套高剂量1.8g／kg，962胶囊低剂量0.9g／kg，每日灌胃给药一次，连续灌胃2个月，进行学习记忆实验(水迷宫)和旷场分析后，每组随机选取5只，灌注固定，冰冻切片，片厚40μm，每份标本均ABC法行NGF和TrK A免疫组化染色。采用法国Noesis Vision公司VISILOG5.0图象分析系统对组织切片进行分析。显微镜放大倍数为10×10，在海马CAl区锥体细胞层连续摄取3个视野，这三个视野包括了整个CAl区，记数3个视野内总阳性细胞数量、 阳性细胞总面积(象素单位)及阳性细胞灰度积分值(灰度单位)。海马CA2区连续摄取2个视野，海马CA3区连续摄取2个视野，海马CA4区摄取齿状回包含的1个视野，包括了整个CA2、CA3、CA4区。数据用均数±标准差表示(M±SD)，结果采用t检验。结果：①老年大鼠海马CAl、CA2、CA3、CA4区NGF表达较青年对照明显减少，阳性细胞数量为青年对照的19.89％，11.46％，6.65％和26.32％；阳性细胞总面积为青年对照的13.97％，6.76％，5.19％和25.01％；阳性细胞灰度积分值为青年对照的41.05％，35.49％，16，74％和29.17％。海马CAl、CA2、CA3、CA4区神经生长因子受体Trk A表达较青年对照也明显减少，阳性细胞数量为青年对照的12.42％，7.07％，9.26％和29.33％；阳性细胞总面积为青年对照的7.61％，4.92％，5.62％和23.79％；阳性细胞灰度积分值为青年对照的29，30％，18.70％，17.51％和34.19％。以CA2、CA3区的减少最严重。⑦中药复方962胶囊和脑复康均能提高老年大鼠海马CAl一CA4区NGF和Trk A阳性细胞数量、阳性细胞总面积和阳性细胞灰度积分值，962胶囊高剂量组基本恢复青年对照组水平。结论：老年大鼠神经生长因子(NGF)及其受体Trk A在海马区表达明显减少，可能与其学习记忆能力下降有关；中药复方962胶囊能够明显促进老年大鼠海马区NGF及受体TrK A表达，可能是改善其学习记忆功能的药理学基础。增强内源性神经营养物质的表达对老年性疾呆的治疗有重要意义。
关键词 中药 老年 大鼠神经生长因子 TrK A受体
前 言
老年性疾呆(Alzheimer’s disease。AD)是一种老年神经退行性疾病，临床以进行性记忆障碍和后天获得性知识丧失为特征，原因不明，尚元有效的治疗方法。自然衰老大鼠模型是比较接近老年性痴呆病理改变的动物模型。我们以往的实验证明：我室自行组方并研制的新复方962胶囊(含何首乌、石葛蒲等六味中药)能显著改善老年大鼠学习记忆功能。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)在调节神经元生长和存活方面起着重要作用，AD过程中神经元的丢失至少部分是由于神经营养因子的缺乏。本文观察自然衰老大鼠脑内是否发生神经生长因子(NGF)及其受体Trk A表达的变化，以及962胶囊对内源性NGF及其受体Trk A表达的影响，探讨962胶囊改善学习记忆功能的作用机理。
材料和方法
1 药品： 中药复方962胶囊，委托北京第四制药厂加工提供，批号：980515，每克干粉含生药量6.25克。实验时采用水溶解，动物灌胃量10m1／kg。阳性对照药品：脑复康 (piracetam)，由北京市曙光制药厂提供，批号：970618，京卫药准字(1996)第138050号。实 验时用水溶解配成0.056g／m1。
2 动物： Wistar大鼠雌性，老年大鼠为22月龄(体重330±32g)，青年为5月龄(体重325±19g)。购于北京医科大学动物中心，动物证号：医动字01—3056。
3 试剂与主要仪器： ABC试剂盒、神经生长因子(NGF)兔抗鼠抗体、酪氨酸蛋白激酶受 体A(Trk A，主要为NGF的受体)兔抗鼠抗体均购自北京中山试剂公司；恒温冷冻切片机为英国山盾公司ASE—620型，光学显微镜为NikonTE300型，图象分析系统为法国NoesisVision公司VISIUG5.0。
4 方法：
(1)分组与给药：分组情况见表1，每日灌胃给药一次，灌胃2个月后，进行学习记忆实验(水迷宫)和旷场分析，然后灌注固定，取材进行组织形态学实验。
表1 大鼠分组给药情况
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分组 |
给药 |
折合成人剂量的倍数 |
|
青年对照 |
水 |
|
|
老年模型 |
水 |
|
|
脑复康 |
脑复康(0.56g／kg) |
7倍 |
|
962胶囊低剂量 |
962胶囊(0.9g／kg) |
7倍 |
|
962胶囊高剂量 |
962胶囊(1.8g从g) |
14倍 |
表2 962胶囊对老年大鼠海马CAl一CA4区神经生长因子(NGF)表达的影响
|
NGF |
海马区 |
青年对照 |
老年模型 |
脑复康 |
962胶囊 |
962胶囊 |
| 阳性细胞数量 |
|
|
(0．56B／k8) |
(0．9B／k8) |
(1，8B／k8) | |
|
CA1 |
119．8±76.3 |
23．8±12．4 |
74．0±59.2 |
78．6±47.7 |
132．1±69．6** | |
|
CA2 |
212．7±110，4** |
24．4±25．8 |
134．1±55．9** |
110．6±83．8* |
147．5±64.1** | |
|
CA3 |
142．5±49.4*** |
9．5±7.5 |
112.O±56.4*** |
75．5±76.9* |
l01．9±53.2** | |
|
CA4 |
38．6±22.6* |
10．2±10．4 |
39．9±21.8* |
36．3±28.3* |
45.l±30.7* | |
|
Total |
513．6±254．4** |
67．8±27．8 |
360．1±177．0** |
300．9±195．8 |
426．6±202.2* | |
|
阳性细胞总面积 |
CA1 |
33．0±22．2* |
4，6±3.4 |
18．1±14．5 |
25．2±18．0* |
39．6±22.4** |
|
CA2 |
80．4±48.5** |
5．4±6.9 |
48．6±27.9** |
44．5±37.9* |
58．1±27.1** | |
|
CA3 |
47．1±21．4*** |
2．4土2．2 |
33.5±20．8** |
28．1±34，3 |
32．5±10．7*** | |
|
CA4 |
11．1±8．6* |
2．8±3.3 |
8．0±4.6* |
13．4±9．6* |
14．0±11．8* | |
|
T0taI |
171．7±90.7* |
15．3±7．6 |
108．2±61.9** |
111．2±81．8* |
146．3±59.6*** | |
|
阳性细胞灰度积分 |
CAl |
35．4±15．0* |
14．5±10．4 |
30．4±15．0 |
29．1±15，7 |
42．8±9.1** |
|
CA2 |
47．4±14．8** |
16．8±13．4 |
60．1±21.4** |
37．2±21.0 |
58．0±17．8** | |
|
CA3 |
45．2±14．4*** |
7．6±7．0 |
61．3±4Q．4** |
32．9±32.9 |
59．4±27.6** | |
|
CA4 |
26．2±16．3* |
7．6±7.8 |
34．0±27.5* |
22．7±19．5 |
35．8±32.4* | |
|
Totd |
154．1±37．9*** |
46．5±22.3 |
185．8±91．5** |
121．9±84．7* |
196．0±75．3** |
表3 962 胶囊对老年大鼠海马CAl—CA4区Trk A表达的影响
|
NGF |
海马区 |
青年对照 |
老年模型 |
脑复康 |
962胶囊 |
962胶囊 |
|
阳性细胞 数量 |
|
|
(0.56g/kg) |
(0.9g／kg) |
(1.8g／kg) | |
|
CAl |
163.9土139.6* |
20.4±16.9 |
77.6±43.7* |
67.1±52.1* |
104.4±89.3* | |
|
CA2 |
205.9±147.0** |
14.6±18.7 |
127.4±78.4** |
102.4±108.7 |
154.8±93.3** | |
|
CA3 |
117.4±68.1** |
10.9±5.4 |
51.5** |
78.7±74.1* |
99.8±55.1** | |
|
CA4 |
51.0±24.0** |
15.0±10.7 |
47.6±26.0* |
30.2±22.1 |
54.1±30.5* | |
|
Total |
538.3±364.7** |
60.8±39.6 |
343.2±183.7** |
278.4±217.5* |
413.1±255.4** | |
|
阳性细胞： |
CA1 |
77.9±59.0* |
5.9±6.6 |
51.6±4.75* |
24.6±16.1* |
41.8±31。7* |
|
CA2 |
l12.9±65.71** |
5.6±9.9 |
70.9±42.8** |
44.1±55.4 |
77.5±54.6** | |
|
CA3 |
56.o±34.3** |
3.1±2.1 |
51.6±31.6** |
31.9±39.3 |
47.3±21.6*** | |
|
CA4 |
28.0±20.0 |
6.7±6.2 |
22.5±11.2* |
12.7±16.0 |
30.2±22.6 | |
|
Total |
274.8±161.5** |
21.3±18.7 |
196.6±115.4** |
113.3±102.2* |
196.8±113.7** | |
|
阳性细胞 |
CA1 |
41.5±26.8* |
12.2±10.6 |
28.6±12.2* |
25.4±26.3 |
38.7±26.5 |
|
CA2 |
45.8±7.2*** |
8.6±8.3 |
43.5±30.9* |
39.4±30.2* |
51.0±29.3** | |
|
CA3 |
43.1±13.4*** |
7.5±4.9 |
43.1±30.5* |
37.9±39.1 |
47.9±30.4** | |
|
CA4 |
28.3±19.2* |
9.7±7.2 |
26.4±18.* |
17.7±14.5 |
20.0±7.40 | |
|
Total |
158.6±35.3*** |
37.9±25.3 |
141.6±86.5* |
120.3±108.1 |
157.6±91.2* |
结论与讨论
神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是最典型、研究最深入的神经营养因子之一， 高水平存在于大脑皮层、海马、嗅球等脑区，主要作用于胆碱能神经元。Trk A受体是神经元细胞膜上NGF的高亲和力受体，NGF与其结合后内在化，经逆行转运至胞体、胞核，引发一系列生理反应，促进神经元增殖和分化，调节中枢和外周存活和轴突生长，并对效应神经元的化学、机械损伤修复起重要作用。NGF和Trk A缺失的小鼠表现大量背根节神经元与交感神经元的丧失以及胆碱能神经元功能缺失。有学者认为AD过程中神经元的丢失至少部分是由于一种或多种神经营养因子的缺乏(如NGF，BDNF，NT3)，这些神经营养因子的受体trkA，trkB，trkC在AD病人脑中分别下降的69％，47％和49％。啮齿动物中，老龄Fischer—334大鼠海马及前脑NGF mRNA水平下降40—50％。国内研究主要使用Wistar及SD大鼠，在衰老过程中NGF水平、寿命、学习能力及某些神经化学、神经形态学变化均与Fischer—334大鼠不同。但对这两类老龄大鼠NGF水平显著性变化目前尚无一致报道。我们的研究证明，老年雌性Wistar大鼠与学习记忆密切相关的海马区锥体细胞层，神经元NGF及其受体TrkA表达(棕色物质)明显降低。有报道老龄大鼠皮质注入标记的NGF，其逆向转运明显减少。不能逆向转运的神经元呈现皱缩和萎缩，伴隔区TrkA mRNA减少。因此笔者认为，NGF逆向转运障碍及NGF水平下降是老龄大鼠脑内起始改变，由此引起神经元的萎缩及受体TrkA减少，进一步降低了NGF的生理效应，最终导致胆碱能神经元的缺失和学习记忆障碍。这一病理过程可能与AD过程相类似。
海马区根据细胞结构的不同分为CA1、CA2、CA3、CA4四个区域，它们都与学习记忆密切相关，但在功能上略有不同。CA2、CA3区是学习记忆的中心区，而CAl、CA4区是学习记忆的周边区。我们的研究发现：老年大鼠海马CAl、CA2、CA3、CA4区NGF表达均较青年对照明显减少，但老年大鼠海马CA2、帜3区NGF的表达减少更严重，与学习记忆的功能分区相一致是造成老年大鼠学习记忆障碍的主要原因。
侧脑室内注射NGF可减少切断隔海马径路或穹窿伞引起的胆碱能神经元退变，老龄大鼠注射NGF可提高胆碱乙酰化转移酶的水平，改善认知及记忆功能，因此NGF治疗AD有理论根据。文献报道脑室内灌注NGF(1—3个月)治疗AD病人3例，出现语言插曲记忆改善，额、颞皮层烟碱结合增加，脑血流增加，说明NGF的治疗意义。然而，外源性NGF价格昂贵，分子量大不易通过血脑屏障，具有严重的副作用(包括体重减轻、疼痛和精神错乱)，并不是理想的治疗方法。因此增加内源性NGF的合成和释放，成为研究AD治疗的重要内容。
962胶囊是我室自行研制开发的中药新药，目前，已完成临床前药效及毒理研究。我们以往的实验证明：962胶囊能显著改善老年大鼠学习记忆功能。本实验发现，在与学习记忆密切相关的海马CAl—CA4区锥体细胞层，962胶囊能明显促进自然衰老大鼠神经生长因子(NGF)及其受体(Trk A)表达，说明其可能含有或导致体内产生能通过血脑屏障的某些小分子物质，促进内源性NGF及其受体合成和释放。962胶囊对学习记忆的中心区一海马CA2、CA3区NGF和Trk A表达的增加作用最强，这一药理基础是其改善老年大鼠学习记忆功能的重要机制，对于保护和修复神经元，防治AD等神经退行性疾病具有重要意义。
