第二法
精密称取供试品适量(相当于维生素D总量600单位以上，重量不超过2.0g)，置皂化瓶中，加乙醇30ml、抗坏血酸0.2g与50％(g／g)氢氧化钾溶液3ml[若供试量为3g，则加50％(g／g)氢氧化钾溶液4ml]，置水浴上加热回流30分钟，冷却后，自冷凝管顶端加水10ml冲洗冷凝管内壁，将皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水60～100ml分数次洗涤,洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的乙醚振摇提取3次，第一次60ml,以后每次 40ml，合并乙醚液，用水洗涤数次，每次约100ml，洗涤时应缓缓旋动，避免乳化,直至水层遇酚酞指示液不再显红色，静置，分取乙醚提取液，加入干燥滤纸条少许振摇除去乙醚提取液中残留的水分，分液漏斗及滤纸条再用少量乙醚洗涤，洗液与提取液合并，置具塞圆底烧瓶中，在水浴上低温蒸发至约5ml，再用氮气流吹干，迅速精密加入甲醇3ml，密塞，超声处理助溶后，移入离心管中，离心，取上清液作为供试品溶液A。
净化用色谱柱系统分离收集维生素D
精密量取上述供试品溶液A 500μl,注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，以甲醇－乙腈－水(50∶50∶2) 为流动相进行分离，检测波长为254nm，从计录仪上观察色谱图，要求维生素D与前维生素D为叠峰，并能与维生素A及其他干扰含量测定的杂质分开；准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液，置具塞圆底烧瓶中，用氮气流迅速吹干,精密加入已知内标浓度的正己烷溶液适量(不少于2ml，并使每1ml中含维生素D为50～140单位,内标物质与维生素D的重量比约为4∶1)，密塞，超声处理助溶，即为供试品溶液B。 医.学.全.在.线www.lindalemus.com
取供试品溶液B，按第一法进行含量测定，进样量为100～200μl。
第三法
供试品溶液的制备
取各该制剂项下制备的供试品溶液A,按上述第二法净化用色谱柱系统分离维生素D项下的方法处理,至“用氮气流迅速吹干”后, 加入异辛烷2ml溶解,通氮排除空气后，密塞，置90℃水浴中，加热1.5小时后，立即通氮在2分钟内吹干，迅速精密加入正己烷2ml，溶解后，即为供试品溶液C。
对照品溶液的制备
精密量取对照品贮备溶液适量,加异辛烷定量稀释制成每1ml中约含维生素D 50单位，精密量取2ml置具塞圆底烧瓶中，照供试品溶液制备项下的方法,自“通氮排除空气后”起，依法操作，得对照品溶液。
含量测定
在上述第一法的色谱条件下，取对照品溶液与供试品溶液C,交替精密进样200μl，量取维生素D的峰值，按外标法计算含量。
