蓖麻毒蛋白

蓖麻毒素

    1.抗肿瘤作用
蓖麻毒蛋白对体外培养的多种肿瘤细胞株和变异细胞株均十分敏感,0.02～0.3mg/ml可以抑制淋巴腺瘤SI、BW5147、MBC2、EL2、骨髓瘤P3、C1、RBS5、S117、S194、J588、MOPC315/P和骨髓样白血病C1498的生长。
蓖麻毒蛋白对小鼠艾氏腹水癌、腹水肝癌、宫颈癌U14、肉瘤S180及白血病等动物移植性肿瘤均有一定治疗作用。于接种后1,3d腹腔注射7.5mg/kg,能够完全抑制艾氏腹水癌细胞生长,使小鼠生存时间延长。1次腹腔注射蓖麻毒蛋白25mg/kg,48小时后可使癌细胞减少90%;96h后几乎所有的癌细胞形态发生如下改变:细胞膨胀,核心出现空泡及有丝分裂停止,胞浆暗染,周围亦出现不规则的空泡等。
蓖麻毒蛋白可以强烈抑制各种癌细胞的蛋白质合成,中等强度抑制DNA合成,而对RNA合成的抑制轻微。二氢蓖麻毒蛋白对家兔lysate的无细胞系统(cell-free system)蛋白质合成有强烈的抑制作用,证明了它不是影响癌细胞的糖代谢或氨基酸的摄取,而是强烈地抑制真核生物核蛋白体的蛋白质合成。
蓖麻毒蛋白具有二个肽链,由S-S链相联。发生作用前有一个裂解过程,裂解后释放出A链和B链,A链称之为效应链(effectomer):B链称之为结合链(haptomer)。B 链可以与细胞表面的碳水化合物受体结合,反游离的A链或者整个毒蛋白分子通过质膜带入胞浆,与核蛋白体60-S亚基发生作用,抑制氨基酰t-RNA与核蛋白体的酰结合,使核酸的延伸因子减少,从而使核酸失活,抑制蛋白质合成,并导致细胞死亡。
具有针对B细胞类Ia抗原特异反应性Mab-737蓖麻毒蛋白通过二硫键连接成免疫毒素蓖麻毒蛋白-737 (ricin-737)。体外0.1M 乳糖存在时,此免疫毒素对含B细胞抗原的Burkitt氏淋巴瘤细胞系Raji细胞表现出选择性地强力杀伤,半数杀伤浓度IC50为5×10\-1M。同样条件,以不含靶抗原的对照细胞K562没有显著杀伤,IC50 为5×10\-8M,毒性比前者低500倍。游离毒蛋白IC50 为5×10\-8M,比免疫毒素毒性低1000倍。动力学研究表明,免疫毒素作用1h就可抑制靶细胞的增殖,并随处理时间延长,杀伤更趋显著。 结果提示,免疫毒素ricin-737具有强烈的选择性杀伤细胞的能力,可成为肿瘤治疗的候选药物。
采用[3H]-亮氨酸掺入及噻唑蓝活细胞两种方法观察了胃癌单克隆抗体一蓖麻毒蛋白A链对人胃癌细胞株KATO Ⅲ(靶细胞)及正常人胚肺细胞SL7(非靶细胞)经24h反应后的杀伤情况。结果表明交联物对肿瘤靶细胞显示选择性杀伤作用,在1×10\-9M水平对靶细胞蛋白质合成抑制率达71%,对非靶细胞无抑制作用。说明McAb对蓖麻毒蛋白A链具有较好的导向能力。
另据报道B链半乳糖结合位点封闭的蓖麻毒蛋白-胃癌单克隆抗体MGb2结合物的制备及其细胞毒特征。首先将引入碘乙酰基团的毒素与引入硫基的抗体反应,得到的结合物通过琼脂糖亲和层析柱除去仍保留半乳糖结合能力的部分。细胞毒性试验结果表明,结合物对肿瘤靶细胞具有较强的选择性杀伤作用,在1.0×10\-1 1mol/L水平,对人胃癌细胞KATO Ⅲ 的杀伤率为46%,优于MGb2-蓖麻毒蛋白A链结合物(12%),而对非靶细胞作用很弱,在1.0×10\-9mol/L水平对正常人胚肺细胞SL7杀伤率仅为42%,无需半乳糖拮抗。
免疫毒素(IT)是较为理想的一类肿瘤定向治疗药物。通过实验将多克隆抗甲胎蛋白抗体(aAFP)与蓖麻毒蛋白A链(RTA)偶联成免疫毒素aAEp-RTA,并采用荧光染色、流式细胞仪技术测定该免疫毒素的体外细胞毒效应,初步证实了山羊抗大鼠aAFP-RTA免疫毒素对大鼠腹水型肝癌AH68细胞具有较强的特异性体外细胞毒效应,用荧光染色、流式细胞仪法测定抗肿瘤药物的体外细胞毒作用具有快速、准确及重复性好等优点。
另据报道,从汀西野生蓖麻籽中提取了两种植物毒蛋白ricin Ⅰ、ricin Ⅱ,其分子量分别为65,67KD。用制备的抗大肠癌单克隆抗体Hb3作为导向载体,与蓖麻毒蛋白A肽链交联,制备杂交分子Hb3-RTA。初步细胞毒试验显示,交联物Hb3-RTA对大肠癌细胞HRT-18具有较强杀伤作用,而对正常人淋巴细胞杀伤作用较小。
将蓖麻毒蛋白和阿霉素偶联到一个抗人膀胱癌单克隆抗体分子上,构建了第一个具有“双弹头”的抗肿瘤导向药物。这个双弹头免疫毒素在0.1M半乳糖存在下,对无关癌细胞无杀伤作用,但对人膀胱癌细胞BIU-87及E-J细胞的杀伤作用比McAb-Ricin强10倍,比McAb-Adriamycin强约30 000倍。该药中Ricin  B链具有细胞结合活性,因此不适于体内应用。但在体外,用0.1M的半乳糖封闭其B链的细胞结合点后,具有高度特异的强靶细胞杀伤活性。
2.热原作用
蓖麻毒蛋白是一个很强的热原物质。它对各种哺乳类动物和人类都具有十分强的致热作用,0,05～0.2mg/kg就可以产生热原反应,比其他任何热原都强而持久,潜伏期也长。大鼠皮下注射蓖麻毒蛋白20mg/kg,3.5h后体温开始升高,持续时间超过6h。反复注射可以产生耐受性,但与细菌类热原物质无交叉耐受性。经所造成的热原反应可用阿司匹林、非那西汀等解势。故认为它可作为解热实验的工具药。
3.免疫反应
蓖麻毒蛋白具有很强的抗原性,以各种途径进入人体或各种哺乳动物体内可产生抗体和过敏反应,种植蓖麻的农民血液中也存在这种抗体,称之为蓖麻毒蛋白抗体,十分稳定,除此之外,还可以使体内非特异抗体升高。此过程中血浆组分发生变化,由于肝毒的作用,白蛋白水平下降,随着肝再生白蛋白水平逐渐上升,α-球蛋白上升,而β-球蛋白下降。说明蓖麻毒蛋白特异地破坏蛋白质的合成可以受抗体的作用而减弱;热原反应也可以被抑制。由于蓖麻毒蛋白能产生细胞毒作用,因此,它能抑制巨噬细胞等参与免疫功能的细胞。
识别普通型急性淋巴细胞白血病抗原(CAL-LA)的单克隆抗体共价连接到完整的蓖麻毒蛋白上,间接免疫荧光显示此免疫毒素(79:Ricin)能与Nalm-1靶细胞结合。克隆化试验表明:半乳糖存在时,10\-9～10\-8M 79:Ricin能杀死99.9%Nalm-1细胞。正常骨髓细胞的存在并不影响它清除靶细胞的效果。79:Ricin免疫毒素对骨髓造血干细胞毒性不大。
以BALB/C小鼠经绵条红细胞(SRBC)免疫后,初次反应产生抗体所导致溶解SR-BC后的光密度值指标,测定了蓖麻毒蛋白对小鼠初次体液免疫应答的影响。结果表明,蓖麻毒蛋白对小鼠的体液免疫功能有明显的抑制作用,光密度值和凝血滴度分别下降到正常小鼠相应数值的1/7和1/9左右。
4.对心血管和呼吸系统的作用
1次静注蓖麻毒蛋白3.2mg/kg是使麻醉免产生心、肝、肾中毒反应的临界剂量,小于此量时对心血管及呼吸系统无明显影响。而麻醉猫注射250～500mg/kg时,血压立即上升,脉搏、呼吸加快和潮气量增加。当注射剂量增至30mg/kg时,血压降至零,心跳停止于舒张期,出现潮式呼吸而死亡;心电图出现R-R间隔延长,P波消失,T波倒置等现象。麻醉猫静注蓖麻毒蛋白250～500mg/kg可以轻微地对抗β-受体兴奋剂异丙肾上腺素。朱注射黎芦碱25μg/kg,然后注射蓖麻毒蛋白可以使肾上腺素、去甲肾上腺素、乙酰胆碱、升压素和组织胺的全部药理学作用减弱。蓖麻毒蛋白还能降低黎芦碱和尼古丁的Bezdd-Jarish反射作用。
5.其他作用
蓖麻毒蛋白可以影响体外培养的各类白细胞的呼吸作用。0.3～3.3mg/ml可降低单核细胞的耗氧量,增加淋细胞的耗氧量;16.6～33.2mg/ml可以降低淋巴细胞的耗氧量,增加嗜中性粒细胞的耗氧量;当浓度增至66.6mg/ml时,嗜中性粒细胞的呼吸亦受抑制。
6.体内过程
蓖麻毒蛋白在体内不易被各种酶水解,故维持较久,而一经水解就很快排出。小鼠腹腔和静脉注射125I一蓖麻毒蛋白后,5h内在各组织和器官内均保持较高的浓度,最高为脾,依次为肾、心、肝和胸腺,然后迅速下降,经10～12h肝脏中消失,其他器官组织经10～30h消失。主要由尿排出,排泄量在5～7h达高峰。

蓖麻毒蛋白对小鼠1次静注的LD50 为6～12mg/kg,但对小鼠的LD50 报道各异,多数报道较上述LD50 为大,乃是样品纯度的差异所致。经DEAE纤维素分级纯化的蓖麻毒蛋白各样品对大鼠1次静脉注射的LD50 为50～150mg/kg。武汉健民制药厂生产的蓖麻毒蛋白对小鼠1次静注的LD50 为47.97mg/kg;对家兔1次静注的MTD为3.2mg/kg;对家兔静注每日1次,连续16次的MTD为1.6mg/kg。 据报道,从汀西野生蓖麻籽中提取的两种植物毒蛋白ricin Ⅰ及 ricin Ⅱ,LD50 分别为0.20μg/kg和0.24μg/kg(小鼠)。 蓖麻毒蛋白可能是一种蛋白分解酶,7mg即可使成人死亡。 蓖麻毒蛋白急性、亚急性中毒的动物(大、小鼠、豚鼠和家兔等)大多数器官和组织都出现功能和形态学的变化,主要毒性反应在肝脏、小肠和内分泌腺体。对肝细胞的破坏作用在内质网,伴随线粒体的轻微改变,从而使肝脏变性坏死。对小肠的损伤亦较严重,是腹泻的主要原因。内分泌系统各器官和组织对蓖麻毒蛋白很敏感。可使动物的下丘脑细胞、肾上腺、垂体、胞腺、睾丸、卵巢、胰腺以及淋巴组织等发生出血性坏死和退行性病变。还能损伤网状内皮系统及引起神经节和胸壁丛的外周神经细胞核染色质破坏。蓖麻毒蛋白引起大鼠急性中毒,主要产生肝及肾的伤害,碳水代谢紊乱。 蓖麻毒蛋白中毒的动物血凝时间延长,这是由于干扰醣代谢和降低凝血酶元、凝血激活酶所致。并可使动物红细胞、白细胞总数升高,血糖及尿素水平升高,使血中镁离子浓度降低、钙离子浓度升高,Ca2+:Mg2+从2:1降至7.75:1,这可能与热原反应有关。蓖麻毒蛋白急性中毒时,动物血液中葡萄糖,肝糖原、总蛋白和红细胞比积均下降,而乳糖、非蛋白氮、氨基酸、无机磷、酸性磷酸盐和乳酸、丙酮升高,肝功能(SGOT、SgPT、LDH)发生紊乱,可见,蓖麻毒蛋白急性中毒时血液学变化与慢性中毒时略有差别。 通过实验研究了蓖麻毒蛋白对BALB/C雄性小鼠的毒性及对昆明种小鼠骨髓多染性红细胞微核的影响。结果表明,BALB/C雄性小鼠腹腔注射8d后,64μg/kg剂量组体重由20.79±0.98g降为19.62±1.00g,体重增长受到明显抑制(P<0.01);0.4、1.6和 6.4μg/kg剂量组白细胞数目依次为9.070±0.751×10 9/L,9.210±0.801×10 9/L和8.207±0.396×10 9/L,与对照组(11.430±1.402×10 9/L)相比显著降低(P<0.05,0.05和0.01);脾和胸腺的重量则没有明显变化。昆明种小鼠腹腔注射24小时后,1.6和 6.4μg/kg剂量组骨髓多染性红细胞微核率为21.90±4.28‰和29.26±3.48‰与对照组(4.94±1.03‰)相比明显增高(P<0.01)。且呈现出剂量一效应关系。此结果提示蓖麻毒蛋白对小鼠有剧毒,对遗传物质也有较大的影响。

用于肿瘤。

蓖麻毒蛋白冷霜和软膏局部应用于宫颈,可能出现腹痛、外阴及全身搔痒、湿疹、荨麻疹、声音发哑、嗓子发痒、喉头水肿、手肢掌脱皮、发冷、发烧等症状,及时对症处理可缓解。

1.《中药有效成分药理与应用》