| 公开(公告)号 | CN1225551C |
| 公开(公告)日 | 2005.11.02 |
| 申请(专利)号 | CN02140481.X |
| 申请日期 | 2002.07.16 |
| 专利名称 | 以两歧双歧杆菌为主微生态制剂的液-固结合发酵工艺 |
| 主分类号 | C12N1/20 |
| 分类号 | C12N1/20 |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 李盛学 |
| 发明(设计)人 | 王厚德;李盛学 |
| 地址 | 132200吉林省永吉经济开发区吉桦路381号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 吉林市达利专利事务所 |
| 代理人 | 张瑜声 |
| 国省代码 | 吉林;22 |
| 主权项 | 以两歧双歧杆菌为主微生态制剂的液——固结合发酵方法，其特征在于该方法由下列过程组成：(1)两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)种培养：①原种液体培养：取大豆蛋白胨3.0-7.0g，胰胨3.0-7.0g，酵母浸膏8.0-12.0g，葡萄糖8.0-12.0g，微量盐溶液30-50ml，其中CaCl20.1-0.4g，MgSO4·7H2O0.3-0.8g，K2HPO40.5-2.0g，KH2PO40.5-2.0g，NaHCO35.0-20.0g，NaCl1.0-3.0g，蒸馏水500-2000ml，调PH6.5-7.5以此作为原种液体培养基；0.1Mpa下灭菌30min，厌氧下速冷至45℃后，立即接种体积百分比为5％的原种溶液，倒在上述培养基上一层0.5-1.0cm厚度的无菌食用植物油，在厌氧下37℃培养24-48h后，终止培养，于厌氧0-4℃保存备用；②一级菌种培养：取蛋白胨6.0-10.0g，酵母浸膏3.0-7.0g，葡萄糖8.0-12.0g，低聚异麦芽糖8.0-12.0g，微量盐溶液30-50ml，其中CaCl20.1-0.4g，MgSO4·7H2O0.3-0.8g，K2HPO40.5-2.0g，KH2PO40.5-2.0g，NaHCO35.0-20.0g，NaCl1.0-3.0g，蒸馏水500-2000ml，PH6.8-7.0，以此作为培养基，0.1MPa下灭菌40min，灌满无色透明的细口瓶，立即在培养基上倒一层0.5cm厚度的无菌食用植物油，冷至42℃，立即接种5％原种培养物，以磨口瓶盖封口，并于37-38℃恒温下培养24-96h，每隔3h摇动1min，细胞数达2亿CFU/ml时，终止培养，厌氧下保存备用；③二级菌种培养：培养基及操作同一级菌种，只是用无色透明试剂瓶，接种一级菌种10％后，每隔4h摇动1min，培养24-96h，待细胞数达2.0亿CFU/ml，终止培养；④三级菌种培养：培养基及各项操作同二级菌种，只是将培养容器改用培养瓶，接种二级菌种10％，细胞达1.8亿CFU/g时终止培养，室温下保存备用；⑤固体培养：取脱脂大豆粉20.0-40.0g、麸皮45.0-65.0g小麦粉8.0-12.0g、脱脂乳粉1.0-3.0g、低聚异麦芽糖1.5-2.5g、葡萄糖0.5-2.0g、酵母浸膏0.05-0.2g，另外加入VB11.0-3.0mg/Kg、VB22.0-6.0mg/Kg生物素0.5-2.0mg/kg，用自来水20-25ml混匀，0.1MPa下灭菌120min，以此作为培养基，冷至42℃无菌下立即接种20％-30％三级菌种，培养物置于无菌无毒不透气塑料袋中，然后向该塑料袋中回灌无氧无菌N2，于37℃进行厌氧培养24-48h，至干基细胞数达4.5亿CFU/g，后终止培养，向该培养物中加入经165℃灭菌的相当于上述固体重量的5-10％葡萄糖、5％淀粉，拌匀后料温控制在30-40℃冷冻真空下干燥或真空下干燥，使含水量≤9.0％，粉碎过60目筛备用；(2)嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)种培养①斜面培养：取酪蛋白胨8.0-12.0g，牛肉浸膏8.0-12.0g，酵母浸膏3.0-7.0g，葡萄糖3.0-7.0g，柠檬酸二胺1.0-3.0g，吐温-80(Tween-80)5.0-15.0ml，K2HPO41.0-3.0g，MgSO4·7H2O0.1-0.3g，MnSO4·H2O0.03-0.08g，CaCO310.0-30.0g，琼脂10.0-20.0g，加蒸馏水1000ml，调节PH6.5-7.5以此作为培养基，0.1MPa灭菌30min，立即接种原种培养物，于37℃厌氧培养3-7d，长满斜面后于厌氧下存放备用；②一级菌种培养：培养基、灭菌同上述原种斜面培养，只是不加琼脂，接种上述原种斜面培养物，于37±1℃下厌氧培养3-4d，至细胞数≥10亿CFU/ml终止培养，室温下保存备用；③二级菌种培养：培养基及操作方法和灭菌同一级菌种培养，培养液冷至40℃接种一级菌种25％，于35-37℃下厌氧培养3-4d，每隔2h摇动1min，至细胞数达10亿CFU/ml时终止培养，室温下保存备用；④三级菌种培养：培养基及灭菌、接种同二级菌种，接种二级菌种10％，至细胞达10亿CFU/ml时终止培养，室温下保存备用；⑤固体培养：取脱脂大豆粉30.0-40.0g，玉米粉25.0-35.0g，大米粉8.0-12.0g，脱脂乳粉3.0-7.0g，麸皮10.0-20.0g，小麦粉2.0-6.0g，白砂糖0.3-0.7g，NaHCO30.3-0.7g，固体粉料加25-32％水混匀，在0.1MPa下灭菌120min，该培养基冷至50℃时，无菌下接种20％三级菌种，培养物置于无菌无毒不透气塑料袋中，然后抽真空，并向该塑料袋中回灌无菌无氧N2，于30-35℃无菌下厌氧培养2-3d，待干基细胞数80亿CFU/g终止培养，然后用45℃热风干燥至含水量为8.0％，粉碎过60目筛备用；(3)嗜热链球菌(StreptococusSalivariussubspthermophilus)种培养各阶段培养基及操作方法、细胞数均同嗜酸乳杆菌；(4)按两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌培养物重量比为65-80∶10-15∶10-16配料，分别准确称取所需重量，再经混匀、无菌下装入胶囊、计数压板、包装、入库。 |
| 摘要 | 本发明属于微生物领域，涉及以两岐双岐杆菌为主微生态制剂的液-固结合发酵方法，由两岐双岐杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜好热链球菌分别依次经原种、1-3级液体培养，和固体培养二阶段组成。制剂中三种菌粉重量比依次为65-80∶10-15∶10-16。固体培养先灭菌，后接种20-30％的三级培养物、置于塑料袋，再抽真空向该无毒无菌塑料袋中回灌无氧无菌N2，解决了固体培养不易成为厌氧环境的关键；如上所述接种量大，比单液或单固培养增加9-10倍；培养中在培养基尤其在固体培养基中加双岐因子，促进活菌增殖至108-109级，且延长保存期，经两年活菌数由38.6亿CFU/g降至5.0亿CFU/g；经毒理试验证无毒，经人群试验，所有受试者均无不良反应，具有调节肠道菌群，增殖双岐杆菌、乳杆菌作用。 |
| 国际公布 |
