| 公开(公告)号 | CN1314804C |
| 公开(公告)日 | 2007.05.09 |
| 申请(专利)号 | CN200510026025.X |
| 申请日期 | 2005.05.20 |
| 专利名称 | 内源基因超量表达技术提高黄芪甲苷含量 |
| 主分类号 | C12N15/09(2006.01)I |
| 分类号 | C12N15/09(2006.01)I;C12N15/10(2006.01)I;C12N15/54(2006.01)I;C12N15/63(2006.01)I;C12N15/87(2006.01)I;C12N15/82(2006.01)I;C12N5/04(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;C12N15/74(2006.01)I;A01H4/00(2006.01)I;A61K36/481(2006.01)I;A61P9/10(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 上海中医药大学 |
| 发明(设计)人 | 杜 旻;胡之璧;刘 涤;周吉燕;王子艳;倪跃元 |
| 地址 | 201203上海市浦东新区蔡伦路1200号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 上海新天专利代理有限公司 |
| 代理人 | 王 巍 |
| 国省代码 | 上海;31 |
| 主权项 | 一种内源基因超量表达技术提高黄芪甲苷含量的方法，其特征在于：包括下列步骤： 1)总核糖核酸提取： 反应试剂的配制：变性液26mM柠檬酸钠pH 4.0，0.5％十二烷基肌氨酸钠，0.125M 2-巯基乙醇，4M异硫氰酸胍；NaAc2M，pH 4.7；酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1；70％乙醇；所有的试剂皆用0.1％焦碳酸二乙酯水处理过的无核糖核酸酶水配制，玻璃容器皆去核糖核酸酶； 操作程序：取适量新鲜植物组织置于陶瓷研钵中，加入液氮快速研磨至细粉末，转移至含有650μl变性液的1.5ml离心管中混匀；加入65μl 2M NaAc pH 4.0，反复颠倒混匀；再加入650μl酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1，混匀，冰浴15min；4℃，12000rpm，离心20min；上清转移至一新的1.5ml离心管中，加等体积异丙醇，混匀后-20℃置30min；4℃，12000rpm，离心10min沉淀核糖核酸；弃上清液，将核糖核酸溶于0.5ml变性液中，65℃加热尽快溶解；加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇，混合溶液重新抽提1次，即重复前步骤；离心后，弃上清液，加75％预冷乙醇1ml，漂洗沉淀，离心同上，弃上清；空气干燥后，加20μl无菌双蒸去离子水溶解核糖核酸，分光光度法和凝胶电泳检测浓度和纯度，余下部分-20℃保存备用； 2)逆转录互补脱氧核糖核酸 寡聚脱氧胸苷酸37.5μM 2μl，总核糖核酸10μg，无菌双蒸去离子水10.5μl，70℃反应10min，立即置冰上，5×逆转录缓冲液4μl，核糖核酸酶抑制剂40U/μl 0.5μl，10mM脱氧核酸核苷三磷酸1μl，逆转录酶200U/μl 1μl，42℃反应1.5h，70℃反应10min灭活逆转录酶； 3)引物设计 根据尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因和腺苷二磷酸葡萄糖苷转移酶基因的互补脱氧核糖核酸序列设计引物 P2：5’-tcgagccttacaggtcctttgg-3’，PxbaI：5’-tttctaatggccaccgctactgc-3’ P20：5’-cctctagatgttgctcttactgctctctc-3’，P21：5’-ccgagctctgtggctcaaaatccttctg-3’ 构建双基因载体时扩增引物为： Psf：5’-cagaagtactattccagtatgacg-3’，Psr：5’-tttcatgatctagtaacatagtgacac-3’ 4)聚合酶链式反应扩增 互补脱氧核糖核酸1μl，引物15μM 2μl，引物25μM 2μl，10×缓冲液2μl，MgCl2 25mM1.6μl，脱氧核酸核苷三磷酸10mM 0.5μl，脱氧核糖核酸聚合酶3U/μl 0.3μl，无菌双蒸去离子水 94℃变性5min→94℃变性0.5min→60℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→30个循环→72℃延伸7min； 5)连接pGEM-T载体： T4脱氧核酸缓冲液10×1μl，pGEM easy载体50ng/μl 1μl，聚合酶链式反应纯化产物适量，T4脱氧核酸连接酶3U/μl 1μl，无菌双蒸去离子水，将反应液混匀后4℃放置； 6)感受态细菌的制备： 从-70℃低温冰箱取出菌种DH5α，接种于LB平板，37℃培养过夜进行活化，从活化平皿上挑取单菌落，接入5ml不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜250rpm，次日按1％V/V比例转入新鲜的LB液体培养基中，37℃振摇培养至OD600＝0.3～0.6也可，在无菌条件下，将50～100ml培养液转入两个预冷的无菌离心管中，冰上静置10min，4℃，4000rpm离心10min，弃去上清液，倒置流尽培养液，加10ml预冷的0.1M CaCl2溶液，重悬浮细菌，冰浴30min，4℃，4000rpm离心10min，弃去上清液，加2ml预冷的0.1M CaCl2溶液，重悬浮细菌，即为感受态细胞； 7)转化与克隆筛选 在制得的感受态细胞中加4μl载体连接质粒脱氧核酸，冰浴30min后，于42℃热激1.5min，冰上冷却1～2min；加入SOC培养基800μl，于37℃，180rpm摇床培养1hr；取培养物100μl铺LB平板加相应的筛选抗生素，再加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷各5μl，37℃恒温培养箱过夜培养，根据蓝白斑筛选阳性克隆； 8)分别以引物对腺苷二磷酸葡萄糖苷转移酶基因特征引物P20-P21、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因特征引物Pxbai-P2扩增腺苷二磷酸葡萄糖苷转移酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因 模板1μl，引物15μM 2μl，引物5μM 2μl，10×缓冲液2μl，MgCl225mM 1.6μl，脱氧核酸核苷三磷酸10mM 0.5μl，脱氧核糖核酸聚合酶3U/μl 0.3μl，无菌双蒸去离子水 94℃变性5min→94℃变性0.5min→45℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→3个循环→94℃变性0.5min→55℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→27个循环→72℃延伸7min，测序； 9)双酶切： 10×双酶切缓冲液10μl，限制性核酸内切酶XbaI 10U/μl 3μl，限制性核酸内切酶SacI 10U/μl 3μl，脱氧核糖核酸10μg，无菌双蒸去离子水 37℃水浴1hr，取出75℃灭活内切酶，取5μl电泳鉴定，其余部分酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1纯化后，加1/10体积的3M NaAc，2体积的乙醇沉淀脱氧核糖核酸，静置10min后，12000rpm，4℃，离心10min，沉淀用70％乙醇洗涤两次后晾干约10min，加适量的无菌水溶解，进行与载体的连接或者-20℃保存待用； 10)质粒pBI121的提取、双酶切 反应试剂的配制：LB液体培养基；溶液150mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM乙二胺四乙酸，pH 8.0；溶液20.2M NaOH，1％ |
| 摘要 | 本发明公开了一种内源基因超量表达技术提高黄芪甲苷含量的方法。本发明将多糖代谢途径的两个代谢反应偶连的关键酶基因ugp基因(尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因)和gbss基因(腺苷二磷酸葡萄糖苷转移酶基因)，经体外修饰，增加强化表达的调控元件，构建成功中间载体，通过电穿孔法将表达中间载体pBI-UG转入发根农杆菌LBA-9402，获得转多糖合成双基因的黄芪毛状根。其中黄芪甲苷的含量比未转基因的黄芪毛状根高6倍。 |
| 国际公布 |
