| 公开(公告)号 | CN1308444C |
| 公开(公告)日 | 2007.04.04 |
| 申请(专利)号 | CN200510064436.8 |
| 申请日期 | 2005.04.15 |
| 专利名称 | 基因重组α-半乳糖苷酶大批量发酵液的纯化方法 |
| 主分类号 | C12N9/40(2006.01)I |
| 分类号 | C12N9/40(2006.01)I;C07K1/18(2006.01)I;C07K1/20(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 |
| 发明(设计)人 | 章扬培;高红伟;鲍国强;高 新;宫 锋;王颖丽;田曙光 |
| 地址 | 100850北京市海淀区太平路27号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 北京纪凯知识产权代理有限公司 |
| 代理人 | 鲁 兵 |
| 国省代码 | 北京;11 |
| 主权项 | 一种基因重组α-半乳糖苷酶大批量发酵液的纯化方法，其特征在于，包括将所述发酵液依次经过阳离子交换层析和疏水层析两步得到纯度为98％以上的重组α-半乳糖苷酶的过程，具体包括以下步骤： 1)发酵液预处理：将所述发酵液通过高速离心回收上清液，用0.2M，pH4.0的磷酸-柠檬酸缓冲液将上清液的pH值调到4.0； 2)阳离子交换： a.以STREAMLINE-SP柱作为阳离子交换层析柱，用1N的NaOH溶液由下向上洗STREAMLINE-SP柱，再用水洗至pH为中性； b.用平衡缓冲液平衡STREAMLINE-SP柱，所述平衡缓冲液为pH4.0的20mM的柠檬酸-磷酸盐缓冲液； c.平衡后上样，用平衡缓冲液由下向上洗掉杂蛋白； d.改变流路，待填料沉积后先用含0.07MNaCl的柠檬酸-磷酸盐缓冲液由上向下洗杂蛋白，再用含0.5MNaCl的柠檬酸-磷酸盐缓冲液由上向下进行洗脱，收集第一洗脱液； 3)疏水层析： a.用50mM、pH6.0、含1M硫酸铵的柠檬酸-磷酸盐缓冲液即HIC平衡缓冲液平衡HiTrap Phenyl HP柱3-5个柱体积，流速20ml/min； b.向第一洗脱液中加入3M硫酸铵溶液和pH6.0的200mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液贮存液使之与HIC平衡缓冲液离子强度一致； c.平衡后上样，流速20ml/min； d.用HIC平衡缓冲液洗掉杂蛋白； e.用pH6.0、含0.4M硫酸铵的50mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液作洗脱液进行洗脱， 收集第二洗脱液；该第二洗脱液得到的为纯度98％以上的重组α-半乳糖苷酶。 |
| 摘要 | 本发明公开了一种基因重组α-半乳糖苷酶发酵液的纯化方法，该方法将发酵液经过阳离子交换层析和疏水层析两步工序，即可得到蛋白纯度大于98％的基因重组α-半乳糖苷酶，为规模化生产高纯度的重组α-半乳糖苷酶提供了解决方案，并且纯化后的基因重组α-半乳糖苷酶内毒素小于10EU，无热源，可用于B→O血型改造、食品添加剂、化工和制药等领域。 |
| 国际公布 |
