| 公开(公告)号 | CN1916173A |
| 公开(公告)日 | 2007.02.21 |
| 申请(专利)号 | CN200610086157.6 |
| 申请日期 | 2006.09.05 |
| 专利名称 | 人胰高糖素样多肽-1与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品 |
| 主分类号 | C12N15/09(2006.01)I |
| 分类号 | C12N15/09(2006.01)I;C12N15/62(2006.01)I;C12N15/14(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I;C07K19/00(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 江南大学 |
| 发明(设计)人 | 金 坚;窦文芳;张莲芬;雷楗勇;卢大儒 |
| 地址 | 214036江苏省无锡市惠河路170号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 无锡市大为专利商标事务所 |
| 代理人 | 时旭丹 |
| 国省代码 | 江苏;32 |
| 主权项 | 人胰高糖素样多肽-1与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法，其特征是人工合成(GLP-1)2cDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSAcDNA；利用重叠PCR技术，连接(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的(GLP-1)2-HSA cDNA融合基因插入到克隆载体中保存；将(GLP-1)2-HSA cDNA融合基因在宿主细胞中进行表达； (1)(GLP-1)2cDNA的克隆： 以人工合成(GLP-1)2cDNA为模板，通过PCR扩增出(GLP-1)2cDNA，所用的引物如下： PG1：5’-TGCGGATCCCACGGTGAAGGTACTTTCACTTCTGA-3’ PG2：5’-ATAGCGGCCGCTTAACGACCCTTAACCAACCAAGC-3’ PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的PG1和PG2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人工合成的(GLP-1)2cDNA 1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为：95℃变性10分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸20秒，循环30次； 通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.2kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBlue2KSP分别经BamHI和NotI双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及BamHI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒BamHI和NotI双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue2KSP-(GLP-1)2，阳性重组子命名为DH5α/pBlue2KSP-(GLP-1)2； (2)HSA cDNA的克隆： 利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA，所用的引物为： PH1：5’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’ PH2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’ PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次； 通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBlue2KSP分别经SalI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue2KSP-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pBlue2KSP-HSA； (3)(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆： (GLP-1)2cDNA的PCR扩增，所用引物如下： PG3：5’-GAGAGGTACCTAAAAAGACACGGTGAAGGTACTTTCACT-3’ PG4：5’-ACCTCACTCTTGTGTGCATCCCTTCCTTTTACTAACCATG-3’ PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的PG3和PG4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue2KSP-(GLP-1)21ng，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸90秒，94℃变性1分钟，循环30次； HSAcDNA的PCR扩增，所用引物如下： PH3：5’-CATGGTTAGTAAAAGGAAGGGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’ PH4：5’-TGAACCGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3’ PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的引物PH 3和PH 4各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue2KSP-HSA 1ng，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次； 利用重叠PCR融合(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA： 将(GLP-1)2的PCR扩增产物和HSA的PCR扩增产物分别稀释40倍，再以1∶1比例混合后作为模板，于反应体系中加入：2mmol/L的dNTP 5μl，10×TaqBuffer 1μl，10mol/LMg2+2.5μl，5U/μl的Taq聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加双蒸水补齐45μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，94℃变性1分钟，循环5次后，向反应体系中加入10μmol/L的PG3和PH4的引物各1.5μl，继续做30次上述循环； 通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.9kb的目标片段，用T4连接酶连接纯化好的目标片段和载体pUC18 |
| 摘要 | 人胰高糖素样多肽-1与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。本发明利用重叠PCR技术，将串联的两个GLP-1基因cDNA(简称(GLP-1)2)和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的(GLP-1)2-HSA cDNA融合基因在宿主细胞中进行表达；本发明的融合蛋白包括与人胰高糖素样多肽-1至少85％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区，两区直接连接，中间不加入任何连接肽，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入。本发明的融合蛋白在保持了人胰高糖素样多肽-1的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。 |
| 国际公布 |
