| 公开(公告)号 | CN1884520A |
| 公开(公告)日 | 2006.12.27 |
| 申请(专利)号 | CN200610088289.2 |
| 申请日期 | 2006.07.10 |
| 专利名称 | 人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品 |
| 主分类号 | C12N15/09(2006.01)I |
| 分类号 | C12N15/09(2006.01)I;C12N15/62(2006.01)I;C12N15/14(2006.01)I;C12N15/26(2006.01)I;C12N15/81(2006.01)I;C07K19/00(2006.01)I;C07K14/55(2006.01)I;C07K14/765(2006.01)I;C12R1/84(2006.01)N |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 江南大学 |
| 发明(设计)人 | 李华钟;金 坚;郭泽峰;王树英;张莲芬 |
| 地址 | 214036江苏省无锡市惠河路170号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 无锡市大为专利商标事务所 |
| 代理人 | 时旭丹 |
| 国省代码 | 江苏;32 |
| 主权项 | 人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法，其特征是通过提取人外周血单核细胞mRNA，然后反转录得到IL-2cDNA，并将IL-2cDNA克隆到pMD19T载体中，PCR从含IL-2cDNA的载体IL-2-pMD19T中直接扩增得到IL-2cDNA；通过PCR从含HSA cDNA质粒中扩增获得HSA cDNA；利用重叠PCR技术，连接IL-2cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的IL-2-HSA cDNA融合体插入到克隆载体；IL-2-HSA cDNA融合体在宿主系统进行表达，IL-2-HSA cDNA融合体被整合到宿主的染色体中； (1)模板mRNA的提取 取用EDTA抗凝的人外周血10mL，在2小时内进行淋巴细胞的分离：将血液小心加入盛有等量淋巴细胞分离液的离心管，注意不要破坏界面；将离心管配平后，放入离心机离心，1000rpm，8分钟；取出离心管，用无菌的移液枪将外周血单核细胞云雾层小心取出，放入另外的洁净试管中；加PBS悬浮，小心振荡数次，800rpm，8分钟，弃上清，加入1640培养基15ml，加青霉素和链霉素均至终浓度为100U/μl；植物血球凝集素梯度加入，分别加0.5ml×2，0.3ml×2，1.0ml×2；放入37℃，5％CO2培养箱中，30～48小时，按照Trizol的说明书提取模板mRNA； (2)IL-2cDNA的反转录和克隆 RT体系：模板1μg mRNA溶液10μL；5×Reverse Transcription Buffer 4μL；10mM的dNTP 2μL；20U的RNase Inhibiter0.5μL；50pmol的Oligo(dT)181μL；5U的Amv Rewerse Transcriptase 1μL；DEPC H2O定容至20μL； 轻轻搅拌，在PCR仪上进行cDNA的合成：42℃，60min，室温放置10min，冰上放置2min，-80℃超低温冰箱保存备用或者直接使用； 以RT-PCR产物为模板，进行如下扩增，引物为： I-1：5′-TGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAG-3′ I-2：5′-GAAGGCCTGATATGTTTTAAGTGGGAAG-3′ 50μl的PCR反应体系中加入：10μmol/L的I-1和I-2各2μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×Taq Buffer 5μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，IL-2cDNA 1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为：95℃充分变性5分钟，94℃变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次； 扩增的产物进行T-A克隆到pMD19 T-Vector中； (3)IL-2c DNA的扩增 从含有人IL-2cDNA的质粒IL-2-pMD19中用PCR的方法扩增，引物如下： IH-1：5′-GGAATTCAAAAGAGCACCTTACTTCAAGTTCTAC-3′ IH-2：5′-ACCTCACTCTTGTGTGCATCAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3′ PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的引物IH-1和引物IH-2各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，IL-2-pMD19 1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为：95℃充分变性5分钟，94℃变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次； 通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.4kb的目标条带，纯化好的目标片段备用； (4)HSA cDNA的PCR扩增 利用PCR从含有HSA cDNA质粒中扩增出HSA cDNA，所用的引物为： IH-3：5′-GCATCATCTCAACACTGACTGATGCACACAAGAGTGAGGT-3′ IH-4：5′-TTGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3′ 50μl的反应体系中加入：10μmol/L的引物IH-3和引物IH-4各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，含有HSAcDNA的质粒pBlue-HSA 1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃充分变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸150秒，循环30次； 通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标条带，纯化好的目标片段备用； (5)IL-2cDNA和HSA cDNA的连接 利用重叠PCR融合IL-2cDNA和HSA cDNA，将IL-2cDNA的PCR扩增产物纯化后和HSAcDNA的PCR扩增产物纯化后按照1∶1的摩尔比混合后作为模板，于50μl的反应体系中加入：2mmol/L的dNTP 5μl，10×Taq Buffer 5μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加双蒸水补齐45μl；PCR条件为：95℃充分变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，循环10次后，向反应体系中加入10μmol/L的IH-1和IH-4的引物各2.5μl，继续做30个上述循环； 通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出2.2kb的目标条带，再双酶切并纯化好的目标片段IL-2-HAS和载体pMD19T按照1∶7的摩尔比用T4连接酶连接；连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR和EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和NotI酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pMD19-IL-2-HSA，阳性重组子命名为XL-1-Blue-pMD 19-IL-2-HSA； (6)融合蛋白IL-2-HSA的酵母表达系统构建 取一支冻存 |
| 摘要 | 人白介素-2(IL-2)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。本发明利用重叠PCR技术，连接IL-2cDNA和HSAcDNA，中间不加入任何连接肽，得到的IL-2-HSA cDNA融合体在宿主系统进行表达，被整合到宿主的染色体中；本发明的融合蛋白包括与人白介素-2至少85％序列同源的第一区和人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入；宿主表达系统可以是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞等。本发明的融合蛋白在保持了人白介素-2的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。 |
| 国际公布 |
