| 公开(公告)号 | CN1873012A |
| 公开(公告)日 | 2006.12.06 |
| 申请(专利)号 | CN200510026345.5 |
| 申请日期 | 2005.06.01 |
| 专利名称 | 重组腺相关病毒（rAAV)载体大规模生产新工艺 |
| 主分类号 | C12N15/861(2006.01)I |
| 分类号 | C12N15/861(2006.01)I;C12N5/06(2006.01)I;C12N5/10(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 上海二医新生基因科技有限公司 |
| 发明(设计)人 | 裘建英;张云福;董西银 |
| 地址 | 201611上海市松江区车墩镇车亭公路128号B-1/10 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | |
| 代理人 | |
| 国省代码 | 上海;31 |
| 主权项 | 重组腺相关病毒(rAAV，recombinant Adeno-Associated Virus)载体的大规模生产化工艺，其新颖性包括以下各步骤的多项参数的改进，具体生产工艺步骤如下： (1)细胞种子扩大 取50L发酵罐所要的HEK293细胞库的种子细胞，接种HEK293至专用发酵罐中，发酵罐培养基在接种前预热至37℃，用二氧化碳来平衡培养液的pH，发酵罐在发酵培养中能自动检测各项参数指标(如：氧分压、二氧化碳分压、pH值、温度、葡萄糖浓度、氨浓度、呼吸比等)，细胞在发酵罐中培养至所需的培养密度约需3-4天的时间，每天检测细胞生长的密度，中间的培养液更换和补充以程控仪表显示参数为依据，培养液为无血清培养液。培养工艺中本发明改进由转瓶到发酵罐大容量悬浮培养和无血清培养，用悬浮培养方法代替贴壁培养，使大规模培养更易操作，也降低了培养液自身带来的动物源性污染，提高产品的安全性。 (2)质粒转染 重组腺相关病毒(rAAV)载体包括ITRs携带目的基因功能区；AAV的Rep启动子和转录子系统Cap；腺相关病毒的辅助系统质粒是腺病毒的表面蛋白的基因，整个转染过程是包装质粒与HEK293共转染。当HEK293细胞培养到适当的密度，约占培养密度的80％左右，历时5天时间，将适量的rAAV质粒加入发酵罐中，进行转染培养。质粒行将转染时，发酵罐暂时停止转动，加入质粒后作轻微搅拌后，再停止一小时，再轻微搅拌几次，再停止一小时，在约5-6小时内，每小时作相同动作，使rAAV与HEK293细胞能很好地受到转染，直至大部分细胞受到转染。值得一提的是HEK293在发酵罐中培养的基本条件，尽量提供与体内生活条件相接近的培养环境，培养环境应具备以下几个因素：所有与细胞接触的设备、器材、溶液等，其中包括种子库细胞培养和放大培养及生产培养过程，都必须保持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染，必须有充足的营养供应，绝对不能含有有害的物质，甚至极微量有害离子；保证有适量的氧气供应；及时清除细胞代谢产生的有害物质；有良好的适宜细胞生存的外界环境，包括渗透压、离子浓度、氨基酸浓度、氧分压、二氧化碳分压、葡萄糖浓度、pH值等，保持合适的细胞密度。 (3)营养更新(介质更新) 细胞在培养过程中由于细胞自我的代谢需要，将吸取营养物质，排出代谢产物，在大容量的培养过程中，要及时补充各种营养物质和氧气等，也要及时清除代谢产物如二氧化碳、氨等，特别在质粒转染前，要先更新和补充培养液，使质粒转染过程中，细胞能大多受到转染，增加转染率，进一步提高产量。 (4)细胞收集 当HEK293与rAAV质粒转染时，达到收集的时候时，将细胞全部收集。可收集程度的指标，依照抽样经显微镜下观察已有大量细胞产生报告基因Lacz比例，或肉眼观察，见大量细胞呈簇状，此时也可以收集细胞。将收集的细胞和培养液进行过滤或离心，富集细胞。 (5)细胞破壁和纯化 富集的细胞经匀浆机(或超声波)破壁，然后离心除去细胞碎片，作过柱的预处理，在快速纯化仪中快速过柱纯化，最后将病毒液转移至透析袋，在4℃下透析，后经安全性和生物活性检测，即得到所需的GMP条件下重组腺相关病毒载体的产品。 1.如权利要求所述的重组腺相关病毒载体的生产工艺，细胞生产培养系统由计算机全程控制的发酵罐进行。 2.如权利要求所述的重组腺相关病毒载体的生产工艺，细胞种植中的接种细胞为HEK293细胞，rAAV和HEK293细胞的繁殖和感染过程中，感染方法是质粒转染。HEK293与rAAV质粒转染率高达90％以上。 3.如权利要求所述的重组腺相关病毒载体的生产工艺，纯化技术采用AmershamBioscience Source 15Q或快速纯化技术。 4.如权利要求所述的重组腺相关病毒载体的生产工艺，产品以水剂(rAAV载体+保护液)和冻干的形式在4℃的冰箱或冰冻柜中保存、运输，以保证产品的生物活性。 5.如权利要求所述的重组腺相关病毒载体的生产工艺，重组体的目的基因是各种疾病有治疗作用的基因(DNA，RNA分子和寡核苷酸)，其治疗范围包括：癌症、心脑血管疾病、老年性疾病、内分泌疾病、自身免疫性疾病、血液性疾病和遗传性疾病。 6.如权利要求所述的重组腺相关病毒载体(携带治疗基因)的产品的受试者是人。 |
| 摘要 | 本发明公开了一种重组腺相关病毒(rAAV)载体在GMP条件下大规模生产的新工艺，解决了腺相关病毒载体从实验室的小量生产，扩大到在GMP条件下的大规模工业化生产的系列难题，使腺相关病毒载体(携带基因治疗)药物的规模生产成于现实。生产工艺步骤包括：细胞种子扩大，细胞培养；质粒转染；营养更新；细胞收集；破壁和纯化；产品罐装和储存。新的质粒转染技术用在大规模生产上，既解决了腺相关病毒产业化生产，又克服辅毒带来的安全性问题。生产工艺具有良好的可控性和操作性，整个生产工艺保证了产品的生物活性，新工艺具有较高的经济效益。 |
| 国际公布 |
