公开(公告)号
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CN1869210A
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公开(公告)日
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2006.11.29
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申请(专利)号
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CN200610040269.8
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申请日期
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2006.07.19
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专利名称
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人谷胱甘肽-S-转移酶Pi的纯化方法及其该酶的应用
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主分类号
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C12N9/10(2006.01)I
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分类号
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C12N9/10(2006.01)I;C12N15/09(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;C12N1/21(2006.01)I;A61K38/45(2006.01)I;A61P31/00(2006.01)I;A61P31/04(2006.01)I
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分案原申请号
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优先权
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申请(专利权)人
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南京师范大学
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发明(设计)人
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殷志敏;沈佳胤;罗 兰;张 泓;王 宇
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地址
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210097江苏省南京市宁海路122号
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颁证日
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国际申请
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进入国家日期
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专利代理机构
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南京苏高专利事务所
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代理人
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阙如生
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国省代码
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江苏;32
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主权项
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一种人谷胱甘肽-S-转移酶Pi的纯化方法,其纯化步骤如下: (1)、将含表达载体pET-28a/hGSTpi的E.coli BL21/DE3菌株接种于含卡那霉素100mg/L的LB固体培养基,每升培养基含胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 10g,琼脂15g,用去离子水定容至1升,37℃振荡培养12h,挑单菌落接种于含卡那霉素100mg/L LB液体培养基,每升培养基含胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 10g,用去离子水定容至1升,37℃振摇培养16h,然后取1mL接种到100mL LB液体培养基,37℃振摇培养2~4h,OD600达到0.5~0.6时,加异丙基β-半乳糖甘至终浓度为0.4mM,继续振摇培养4h,12,500g离心10min收集菌体; (2)、按每g菌体沉淀加5mL 0.5M NaCl,20mM Tris-HCl,5mM咪唑,PH7.9的结合缓冲液重悬诱导表达后收集的菌体沉淀,经超声破碎后,12,500g,4℃离心15min后取上清,上清与经结合缓冲液预平衡过的IDA-Ni2+树脂在4℃结合40min,用以上结合缓冲液洗涤柱3次,再用0.5M NaCl,20mM Tris-HCl,60mM咪唑,PH7.9的洗涤缓冲液洗涤2次,用0.5M NaCl,20mM Tris-HCl,1M咪唑,PH7.9的洗脱缓冲液洗脱3次; (3)、合并3次洗脱液上清,用0.5M NaCl,20mMTris-HCl,PH7.9的透析液1透析去咪唑,再用0.1M磷酸钾,1mM EDTA,PH6.5透析液2透析测定酶活性; (4)、用140mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4的PBS缓冲液透析测定蛋白浓度,用凝血酶水解切割His6标签,得到人谷胱甘肽-S-转移酶hGSTpi。
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摘要
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本发明公开了一种人谷胱甘肽-S-转移酶Pi的纯化方法,其方法步骤为:(1)将含表达载体pET-28a/hGSTpi的E.coli BL21/DE3菌株接种于LB固体培养基,振荡培养,离心收集菌体;(2)按每g菌体沉淀加入pH7.9的结合缓冲液重悬收集菌体沉淀,经超声破碎、离心后取上清液,用缓冲液洗脱;(3)将洗脱上清用透析液1透析去咪唑,再用透析液2透析测定酶活性;(4)用PBS缓冲液透析,用凝血酶水解切割His6标签,获得人谷胱甘肽-S-转移酶hGSTpi。本发明方法纯化得到的hGSTpi重组蛋白纯度高,且空气氧化形成的无活性二聚体少,hGSTpi在炎症治疗中的应用,不仅能有效控制炎症,而且对机体免疫系统的影响小,副作用极小。
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国际公布
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