| 公开(公告)号 | CN1840707A |
| 公开(公告)日 | 2006.10.04 |
| 申请(专利)号 | CN200610013091.8 |
| 申请日期 | 2006.01.23 |
| 专利名称 | 基于免疫耐受树突细胞筛选免疫耐受相关疾病的基因RGS1的方法 |
| 主分类号 | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分类号 | C12Q1/68(2006.01)I;C12Q1/04(2006.01)I;C12N5/08(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 南开大学 |
| 发明(设计)人 | 杨荣存;刘 昱;R.卢登;W.如适;张 园;张灼寒 |
| 地址 | 300071天津市卫津路94号南开大学医学院 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 天津市学苑有限责任专利代理事务所 |
| 代理人 | 赵尊生 |
| 国省代码 | 天津;12 |
| 主权项 | 一种基于免疫耐受树突细胞筛选免疫耐受相关疾病的基因RGS1的方法，，其特征在于包括下述步骤： (1)免疫耐受树突细胞的制备和鉴定 1)取4-6周小鼠的骨髓细胞，用水溶解去除红细胞后，在1000单位GM-CSF，10％FCSRPMI1640培养基中培养，37℃下培养4天的骨髓起源的树突细胞作为未成熟的树突细胞； 2)未成熟的树突细胞用生理盐水洗三次，分别与鼠卵巢癌肿瘤细胞，已照射卵巢癌细胞或卵巢癌细胞上清液共同培养9天； 3)用2μlFITC萤光素标记的CD80抗体染鼠卵巢肿瘤细胞与树突细胞，鼠卵巢肿瘤细胞与树突细胞混和培养在10％FCSRPMI1640培养基中，37℃培养9天，用流式细胞仪分离树突细胞，得免疫耐受树突细胞； 4)首先对免疫耐受树突细胞的形态结构进行了观察，观察肿瘤相关免疫耐受树突细胞的形态与结构； 5)肿瘤相关免疫耐受树突细胞用生理盐水洗三次后，分别加2μlFITC萤光素标记的抗CD40、CD80和CD86抗体染色，流式细胞仪分析，分析免疫耐受树突细胞刺激分子的表达； 6)用类乳头瘤病毒质粒(VLP)免疫鼠引导的特异性T细胞作为靶细胞，肿瘤相关免疫耐受树突细胞与对照树突细胞在装载类乳头瘤病毒质粒(VLP)后作为刺激细胞；共同培养48小时，取上清液，通过酶联免疫检测试剂盒分析上清液中的IFN-γ含量； (2)免疫耐受树突细胞内免疫耐受基因的筛选 1)用Trizol试剂从肿瘤相关性树突细胞提取总RNA； 2)对肿瘤相关性树突细胞总RNA通过基因芯片进行分析，所用基因芯片是AffymetrixMouseU74GeneChipseries(U74A，U74B和U74C)，由美国约翰霍普金斯大学医学院基因组研究室分析： 1、用寡核苷酸和dT作为引物以及SuperScriptchoice合成单股cDNA； 2、然后合成双股cDNA，双股cDNA通过苯酚-氯仿(1∶1体积)抽提后，利用BioArrayRNAhighyieldTranscriptlabeling试剂盒，通过体外转录产生Biomylatedanti-sensecRNA； 3、处理过的cRNA在45℃下与Affymetrix基因组基因芯片杂交，用AffymetrixFluidicsStation400洗染基因芯片除去未杂交的cRNA，然后用streptavidin-PE结合BiotimylatedcRNA，再与羊抗-streptavidinAb孵育；用Hewlett-PackardG2500GeneArray检测荧光强度，用MicroArraySuite5.0软件对每个基因芯片进行图像分析； 4、采用AgilentBioanalyzer(PaloAlto，CA)与“Labonachip”(芯片实验室)进行证实所有样本有着类似的rRNA比率， 5、根据美国基因库提供生物信息，对在肿瘤相关免疫耐受树突细胞基因芯片分析中明显上调的基因或明显下调的基因结合基因库提供生物信息进行分析； 6、RGS1基因在肿瘤相关的树突细胞的高水平表达通过半定量PCR和定量PCR进一步评价，根据基因库提供生物信息，找出在肿瘤相关免疫耐受树突细胞中明显上调的RGS1基因序列；序列： 5’atgccaggaatgttcttttctgctagcccaaaggattcgaaagaacacagccattctctt ctagacgacaaaaagcagaaaaaaaggccaaagacttttggaatggacgtgaaaacatac ctgagatcgatgatcccacatctggaatctgggatgaaatcggccaagtccaaagacata ctttctgctgaagaagtaatgcagtggtctcagtctctggaaaaactccttgccaaccag acaggtcaaaatgtctttggaagatttctaaagtctgaattcagtgaggaaaatattgaa ttctggttggcttgtgaggactataagaaaacagagactgatcttttgcataacaaagca gagaatatatacaaagcatttgtgcattcagatgctgtgaaacaaatcaatattgacttc catactcgagaatcgacagccaagaagattaaaacaccaactcccacatcttttgatgaa gcacaaaaagtcatatattcactcatggaaaaagattcttatcccaggttcctgaaatca aatatttacttaaatcttctaaatgaccttcaggcaaatactttaaagtga3’ 设计RGS1基因引物：5’atgccaggaatgttcttttctgctag-3’和3’ctttaaagtatttgcctgaaggtc-5’，用Invitrogen提供的RT-PCR试剂盒进行分析，用SybrGreenI检测模式通过定量PCR，用TAKARA公司提供的SYBRgreenI萤光染料测定RGS1的转录水平； (3)克隆RGS1基因 从肿瘤相关性树突细胞用Trizol试剂提取总RNA，用RGS1引物：5’atgccaggaatgttcttttctgctag-3’和3’ctttaaagtatttgcctgaaggtc-5’，通过Invitrogen公司提供的RT-PCR试剂盒，按照该公司提供的实验步骤扩增RGS1基因，通过Invitrogen胶提取试剂盒提取扩增的RGS1基因片段，然后通过Invitrogen公司提供的pCDNA3.1His/V5ToPo载体，根据该公司提供的实验步骤将RGS1基因克隆到pCDNA3.1His/V5ToPo载体，最后，通过测序确定上述列出的RGS1序列； (4)对筛选的肿瘤相关免疫耐受相关基因功能进一步鉴定： 1)用载有免疫耐受基因RGS1载体与pNF-KappaB-Seap报告基因通过lipofectin2000(Invitrogen)共同转染RAW264.7细胞，然后用1μg/mlLPS或25μg/mlPolyI:C刺激，24小时后吸取上清液，上清液用，GreatEscApeSEAPChernilumineScence检测试剂盒分析上清液的化学发光强度； 2)肿瘤相关免疫耐受基因RGS1转染的RAW264.7，在600μg/mlG418选择条件下，建立稳定转染的细胞系，染色后通过流式细胞仪分析这些稳定转染的细胞表面刺激分子CD40、CD80和CD86及其它共刺激分子的表达；同时，分析这 |
| 摘要 | 本发明提供了基于免疫耐受树突细胞筛选免疫耐受相关疾病基因RGS1的方法。通过体外培养建立了制备人免疫耐受树突细胞，RGS1基因在免疫耐受树突细胞中的表达明显升高。当RGS1基因或靶向这些基因的siRNA转染单核细胞系，影响转录因素的激活，细胞因子的产生和共刺激分子的表达；重要的是转染免疫调节细胞树突细胞后能够发挥特有的免疫调节功能，引导免疫耐受。这些基因在免疫相关性疾病如抗移植排斥反应、肿瘤、炎症、自身免疫性疾病的治疗方面有着巨大的潜在应用价值。 |
| 国际公布 |
