| 公开(公告)号 | CN1840708A |
| 公开(公告)日 | 2006.10.04 |
| 申请(专利)号 | CN200610013092.2 |
| 申请日期 | 2006.01.23 |
| 专利名称 | 用于治疗免疫耐受相关疾病的基因的筛选和鉴定方法 |
| 主分类号 | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分类号 | C12Q1/68(2006.01)I;C12Q1/04(2006.01)I;C12N5/08(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 南开大学 |
| 发明(设计)人 | 杨荣存;R.卢登;W.如适;张 园 |
| 地址 | 300071天津市卫津路94号南开大学医学院 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 天津市学苑有限责任专利代理事务所 |
| 代理人 | 赵尊生 |
| 国省代码 | 天津;12 |
| 主权项 | 一种用于治疗免疫耐受相关疾病的基因的筛选和鉴定方法，其特征在于包括下述步骤： (1)免疫耐受树突细胞的制备和鉴定 1)从卵巢癌患者的全血用Ficoll分离出白细胞，用生理盐水洗三次放入装有培养基的培养瓶中培养1小时，保留粘附在培养瓶上的单核细胞，反复用生理盐水冲洗去除非粘附的细胞，然后加入6ml含有1000U的人GM-CSF和1000UIL-4，继续培养4天，得到的树突细胞作为未成熟的树突细胞；培养基含有10％小牛血清的PRMI1640培养基，同时加入1％的青和1％链霉素。 2)将培养4天的未成熟的树突细胞，用生理盐水洗三次，在24孔板分别与来自同一病人的卵巢癌肿瘤细胞、用Co60已照射卵巢癌细胞或卵巢癌细胞上清液共同培养9天；卵巢肿瘤细胞与树突细胞的比例为1∶10(数量比)；所述的卵巢癌肿瘤细胞是从卵巢癌患者新鲜的腹水中分离的肿瘤细胞，采用磁力珠分离方法去除潜在污染的淋巴细胞。 3)使用流式细胞仪将培养9天后的树突细胞与卵巢癌细胞分离，得到树突细胞； 4)鉴定免疫耐受树突细胞：免疫耐受树突细胞用生理盐水洗三次后，分别加PharminGen公司提供的2μlFITC萤光素标记的抗CD40、CD80和CD86抗体染色，用流式细胞仪分析，分析免疫耐受树突细胞刺激分子的表达； 5)用同一病人外周血引导流感病毒多肽“Mp58-66peptide(GILGFVFTL，GIL；designatedasA2-GIL)”特异性的HLA-0201限制性T细胞系，分离的人T细胞与装载流感病毒多肽的树突细胞共同培养，每周刺激一次，共刺激三次。肿瘤相关免疫耐受树突细胞与对照树突细胞在装载流感病毒多肽“Mp58-66peptide后作为刺激细胞，共同培养48小时，取上清液，通过酶联试剂盒分析上清液中的IFN-γ(干扰素γ)含量。 6)分析免疫耐受树突细胞引导CD4+CD25+T调节细胞的能力，当肿瘤相关的免疫耐受树突细胞或对照树突细胞与来自同一病人T细胞在一定比例(树突细胞∶T细胞＝1∶10)共同培养9天，通过FITC标记的抗CD4抗体和PE标记的抗CD25抗体染色和流式细胞仪分析肿瘤相关的免疫耐受树突细胞引导CD4+CD25+T调节细胞产生。 7)分析免疫耐受树突细胞产生细胞因子的能力。用半定量PCR测定免疫耐受树突细胞IL-10和IL-12的转录水平，用Invitrogen公司提供的RT-PCR试剂盒测定IL-10和IL-12的转录水平，IL-10引物：5’atgcacagctcagcactgctctgttgc3’和3’gtttcgtatcttcattgtcatg5’；IL-12p40引物：5’atgtgtcaccagcagttggtcatctc3’3’actgcagggcacagatgcccattc5’。 (2)免疫耐受树突细胞内免疫耐受基因的筛选 1)首先按照Invitrogen公司提供的步骤，从肿瘤相关性树突细胞用Trizol试剂提取总RNA； 2)对肿瘤相关性树突细胞总RNA通过基因芯片进行分析，所用基因芯片是Affymetrixhumangenechipplatforms，由美国约翰霍普金斯大学医学院(TheJohneHopkinsUniversitySchoolofMedicine)基因组研究室分析； (3)筛选和鉴定免疫耐受相关基因 1)、首先，用寡核苷酸和dT作为引物(Proligo，Boulder，co)以及SuperScriptchoice合成单股cDNA。 2)、然后合成双股cDNA，双股cDNA通过苯酚-氯仿抽提后(等体积，1∶1)，利用BioArrayRNAhighyieldTranscriptlabeling试剂盒(InzoBioche)，通过体外转录产生Biomylatedanti-sensecRNA。 3)随后处理过的cRNA与在45℃与Affymetrix基因组基因芯片杂交，用AffymetrixFluidicsStation400洗染芯片除去未杂交的cRNA，然后用streptavidin-PE结合BiotimylatedcRNA，再与羊抗-streptavidinAb孵育，用Hewlett-PackardG2500GeneArray检测荧光强度，用MicroArraySuite5.0软件(Affymetrix公司)对每个基因芯片进行图像分析； 4)采用AgilentBioanalyzer(PaloAlto，CA)，“Labonachip”(芯片实验室)技术证实所有样本有着类似的rRNA比率； 5)根据美国NIH基因库提供的生物信息，对在肿瘤相关免疫耐受树突细胞基因芯片分析中明显上调的基因或明显下调的基因，结合基因库提供生物信息进行分析。 |
| 摘要 | 本发明提供了用于治疗免疫耐受相关疾病的基因的筛选和鉴定方法。通过体外培养建立了制备人免疫耐受树突细胞的方法。对肿瘤相关免疫耐受树突细胞遗传背景分析，筛选和鉴定了树突细胞内与免疫耐受功能有关的基因：FLJ20151、FLJ23306、FLJ20151、FLJ21080、FLJ10055、FLJ20967、FLJ12287、FLJ11565、MGC45806或DKFZp434K1210。，这些基因参与免疫耐受的引导，在免疫相关性疾病如抗移植排斥反应、肿瘤、炎症、自身免疫性疾病有着潜在的应用价值。 |
| 国际公布 |
