| 公开(公告)号 | CN1810987A |
| 公开(公告)日 | 2006.08.02 |
| 申请(专利)号 | CN200510013151.1 |
| 申请日期 | 2005.01.28 |
| 专利名称 | 乳腺癌转移中参与分化等作用基因的分离及分离方法 |
| 主分类号 | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分类号 | C12Q1/68(2006.01)I;C12P19/34(2006.01)I;C12N5/06(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 南开大学 |
| 发明(设计)人 | 张晓东;叶丽虹;吴莲英;尤嘉琮;蔡 娜 |
| 地址 | 300071天津市卫津路94号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 天津市学苑有限责任专利代理事务所 |
| 代理人 | 郑 楠 |
| 国省代码 | 天津;12 |
| 主权项 | 一种乳腺癌转移中相关基因的分离方法，其特征在于包括： 1)用SCID(Severecombinedimmunodeficiency，SCID)鼠从人乳腺癌细胞系MCF-7中筛选和建立具有高转移倾向的转移亚克隆LM-MCF-7细胞系； 2)细胞培养 将LM-MCF-7和MCF-7细胞用RPMI1640(含有10％FBS、100u/ml硫酸链霉素和100u/ml青霉素)培养液，在37℃、5％CO2条件下CO2培养箱中培养； 3)总RNA提取 一步法提取MCF-7和LM-MCF-7细胞的总RNA，用异丙醇沉淀，并过柱纯化； 4)cDNA反转录及荧光标记 取一定量总RNA，以T7-Oligo(dT)15为引物，合成双链cDNA，纯化；之后将双链cDNA进行体外转录合成cRNA、纯化；取cRNA，用SuperscriptII反转录酶(200u/μl)，9个碱基的随机序列寡核苷酸引物反转录为cDNA并纯化；取cDNA，用9个碱基的随机序列寡核苷酸引物和KLENOW酶进行荧光标记，之后纯化并抽干；标记过程中dATP，dGTP，dTTP使用浓度为120μM，dCTP为60μM，Cy5-dCTP，Cy3-dCTP为40μM，dNTP为10mM； 5)制备人寡聚核苷酸标准基因芯片 将Qiagen公司人类基因的Oligo库中的寡聚DNA点制在一张75×25mm、经过化学修饰的载玻片上；点制在芯片上的样品还包括人的12个看家基因作为阳性对照，12条人工合成的与人基因没有同源性的70个碱基的寡聚DNA作为阴性对照，以及拟南芥的3个基因作为外标；整个点阵分成48个亚阵；每个亚阵有22行，22列；点间距为185μm，点的直径约为140μm； 6)杂交与洗涤 将标记的DNA溶于35μl杂交液中，放入标准基因芯片于42℃杂交过夜；杂交结束后，将芯片在42℃含有0.2％SDS和2×SSC的液体中洗5分钟，再在0.2×SSC中室温洗5分钟，最后甩干用于扫描； 杂交液的组份为：3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺； 7)筛选确定 用ScanArrayExpress双通道激光扫描仪扫描基因芯片，用GenePixPro4.0软件分析芯片上每个点Cy3和Cy5荧光信号的强度和比值，并用Lowess方法归一化；以差异为两倍(即比值大于2.0，小于0.5)的标准来确定差异表达基因。 |
| 摘要 | 本发明公开了一种高精确度、高通量筛选在乳腺癌转移中参与分化、发育、信号转导和应激反应等作用基因的分离方法。本发明方法通过建立具有高转移倾向的转移亚克隆LM-MCF-7细胞系与其亲本人乳腺癌细胞系MCF-7形成配对细胞系作为实验样本，不仪可随时无限量培养获得，且由于实验样本的细胞成分均一，保证了分离结果的精确性和准确性。本发明方法还通过基因表达谱芯片技术分离出了这些相关的基因，这些基因的表达和功能的确认，在乳腺癌药物或基因治疗方面以及在用于制备肿瘤转移芯片、制备抗肿瘤转移基因疫苗及建立抗肿瘤转移药物筛选技术平台方面，都将有着重要的实际应用价值。 |
| 国际公布 |
