| 公开(公告)号 | CN1793324A |
| 公开(公告)日 | 2006.06.28 |
| 申请(专利)号 | CN200510045207.1 |
| 申请日期 | 2005.11.25 |
| 专利名称 | 利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素-β的方法 |
| 主分类号 | C12N1/19(2006.01)I |
| 分类号 | C12N1/19(2006.01)I;C12N15/22(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I;C12R1/84(2006.01)N |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 山东大学 |
| 发明(设计)人 | 陈 敏;王庆杰;王 鹏 |
| 地址 | 250100山东省济南市历城区山大南路27号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 济南金迪知识产权代理有限公司 |
| 代理人 | 鲍光明 |
| 国省代码 | 山东;37 |
| 主权项 | 一种利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素-β的方法，由下述步骤组成 (1)重组表达载体的构建： 克隆出人IFNβ基因，通过PCR方法将IFNβ基因起始密码子ATG前增加KR＝AAAAGA序列，以提高Kex2蛋白酶的酶切作用，避免毕赤酵母分泌表达外源基因时存在信号肽切割不完全，使重组蛋白N端带有信号肽氨基酸序列的情况；同时末端Arg的碱基CGA设计为毕赤酵母喜好密码子AGA，以提高IFNβ在毕赤酵母中的表达；完成分子水平基因改造后将基因构建到酵母表达载体中，得重组表达载体； (2)重组酵母菌株的构建： 用SalI将重组载体pPIC9kIFNβ线性化；电转到酵母菌株基因组中，构建重组酵母菌株；在MD平板上长出的菌落为阳性克隆；其中，MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；通过G418抗生素筛选出高拷贝的阳性菌株； (3)人干扰素-β蛋白在酵母中诱导表达： 将上述阳性菌株，接种于YPD培养基中，30℃培养12-24小时，摇床转速为240-270转/分；当发酵液浓度达OD＝5-6时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为240-270转/分，培养28～35小时；5000g离心5～10分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体1～2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝0.5-1.0时，诱导培养，诱导温度20℃-30℃，摇床转速为180-250转/分，每隔12小时向培养基中加入5～10ml/L量的甲醇，培养24-96小时； 其中PBS为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液； 其中YPD培养基配方为：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖； 其中BMG培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L； 其中BMM液体培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L； 其中，上述重组阳性克隆工程菌株可以通过离心、过滤去除； (4)重组蛋白提取及纯化 选用蓝谱直接将酵母菌株的上清液进行重组蛋白的纯化； (5)对重组蛋白进行表面糖链的改造 选用外切糖苷酶对所得重组蛋白进行糖基化改造；在一定的酶反应条件下切除重组干扰素β蛋白的糖链部分。 |
| 摘要 | 本发明公开了一种利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素-β的方法。本发明应用重组DNA技术在甲醇酵母细胞如巴斯德毕赤酵母细胞中生产基因重组人干扰素β并进行糖基化改造的方法，获得既具有真核生物的蛋白翻译后修饰和加工，又不具有抗原性的干扰素β蛋白。本发明还涉及适合甲醇酵母表达的人干扰素β改构基因的设计；表达载体的构建；基因组中至少稳定地整合有一个拷贝改构干扰素β基因的甲醇酵母工程菌；工程菌的基因表达；糖基化改造等方面。本发明方法可实现干扰素β高效表达及糖链改造，且分离工艺简便。所产生的干扰素β不具有酵母蛋白的N-糖基化，若作为蛋白药物不会在人体内产生免疫源性；也不会因为过糖基化使表达蛋白失去活性。 |
| 国际公布 |
