| 公开(公告)号 | CN1786164A |
| 公开(公告)日 | 2006.06.14 |
| 申请(专利)号 | CN200510019706.3 |
| 申请日期 | 2005.11.01 |
| 专利名称 | 一种重组人tPA的制备方法 |
| 主分类号 | C12N15/09(2006.01)I |
| 分类号 | C12N15/09(2006.01)I;C12N1/21(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I;C07K1/14(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 武汉大学;武汉陆地生物工程有限公司 |
| 发明(设计)人 | 叶林柏;吴正辉;佘应龙;叶 力;郜金荣 |
| 地址 | 430072湖北省武汉市武昌珞珈山 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 武汉宇晨专利事务所 |
| 代理人 | 王敏锋 |
| 国省代码 | 湖北;42 |
| 主权项 | 一种重组人tPA的制备方法，它包括下列步骤： A、利用工程菌株BL21/rtPAm-1，进行发酵生产重组tPA，工程菌株BL21(DE3)/rtPAm-1，CCTCCM205112，利用工程菌株BL21/rtPAm-1发酵生产重组人tPA包括步骤：首先是斜面种子培养：用LB培养基，37℃培养18-20小时；其次是瓶摇种子制备：用2YT培养基，摇瓶培养，37℃培养12-14小时；第三是发酵培养：用发酵培养基，37℃进行发酵培养和诱导蛋白质表达； B、tPA包涵体的提取和纯化： 离心收集菌体，超声波破碎菌体，离心去上清，沉淀用pH8.0的Tris-NaCl-吐温-20和纯净水各洗涤三次； C、包涵体的溶解和变性： 按5-10克tPA湿重/升的量将tPA包涵体加到7-8M尿素中，用NaOH调节pH至9-10，加入还原剂β-巯基乙醇至10-20mM，28-32℃搅拌溶解0.5-1小时，进行溶解和变性； D、tPA复性，其方法如下： (a)加水将变性液稀释一倍，使尿素浓度降至4M以下，tPA开始复性； (b)用G50Sephadex分子筛柱层析逐渐去除复性液中的尿素和还原剂β-巯基乙醇，使tPA逐步复性，同时又去除分子量30kD以下的杂蛋白； (c)将收集的tPA溶液用pH8.0的10mM-20mMTris-Cl进行稀释，至tPA浓度为1-2克湿重/升，在20-25℃及pH8.0的条件下，放置16-24小时，进行进一步复性； E、柱层析纯化和浓缩： (a)用Q-Sepharose4FF柱分离复性正确和复性不正确的tPA蛋白，柱子先用0.5MHCl进行预处理，再用水洗至pH5.0-6.0，然后用2倍体积的pH8.0-8.5的20mMTris-Cl进行平衡，复性液经过滤后，加入pH8.0的Tris-Cl至20mM，上柱，用pH7.5的10mMTris-Cl，0.1-0.5MNaCl进行梯度洗脱，收集有活性的tPA洗脱峰，或用pH7.5的10mMTris-Cl，0.15-0.2MNaCl洗脱杂蛋白，再用pH7.5的10mMTris-Cl，0.25-0.35MNaCl洗脱有活性的tPA； (b)进一步用疏水层析柱Phenyl-Sepharose6FF对tPA进行纯化，柱子用pH6.5-7.5的5mMTris-Cl，0.4-0.6MNaCl进行平衡，在Q-Sepharose4FF柱洗脱的tPA液中加入NaCl至0.4-0.6M，用HCl调节pH至7.0-7.5，上柱，用pH8.0-9.0的2.5-5mMTris进行洗脱，收集有活性的tPA； (c)用膜滤器对tPA洗脱液进行浓缩，至tPA浓度3×105IU/ml； F、tPA冷冻干粉针剂制备： 采用冷冻干燥法将浓缩的tPA溶液制成冷冻干粉制剂。 |
| 摘要 | 本发明公开了一种重组人tPA的制备方法，包括了从工程菌株发酵生产，tPA包涵体的提取、复性、纯化、浓缩，到tPA产品的冷冻干粉制备等的全套生产工艺，其中重点解决了tPA包涵体的复性、tPA纯化等关键技术。利用本发明所提供的制备方法，从10L发酵体积中可生产tPA晶体湿重10克以上，变性、复性后总活性可高达3-4×108IU，总的复性效率＞10％，复性后有活性tPA的回收率达到60％，纯化后tPA的纯度达99％以上。本发明提供的tPA制备方法具有产量高、操作简便、成本低廉、效率高的优点，所提供的生产工艺可很快转化为工业化生产工艺。 |
| 国际公布 |
