通过检测人类T细胞受体TCR基因在治疗前后的变化来评价治疗HIV药物疗效的方法
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公开(公告)号
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CN1253584C
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公开(公告)日
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2006.04.26
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申请(专利)号
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CN02131070.X
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申请日期
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2002.09.28
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专利名称
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通过检测人类T细胞受体TCR基因在治疗前后的变化来评价治疗HIV药物疗效的方法
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主分类号
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C12Q1/68(2006.01)I
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分类号
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C12Q1/68(2006.01)I
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分案原申请号
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优先权
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申请(专利权)人
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北京佰仁思生物工程有限责任公司
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发明(设计)人
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寇忠琛
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地址
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102200北京市海淀区中关村科技园区昌平园星火街6号
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颁证日
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国际申请
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进入国家日期
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专利代理机构
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北京汇泽知识产权代理有限公司
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代理人
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张若华
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国省代码
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北京;11
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主权项
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通过检测人类T细胞受体TCR基因在治疗前后的变化来评价治疗HIV药物疗效的方法，其步骤为： a.血样经采集分离后，得到外周血单个核细胞，再进一步分离出CD4或CD8T细胞； b.分离和提纯出T细胞的mRNA后，通过mRNA合成得到cDNA； c.在极其靠近CDR3区段V基因区设计22个内侧Vβ基因引物和一个内侧Cβ基因引物，Cβ基因引物的5′端插入七个非模板碱基GTTTCTT，Cβ基因引物采用高灵敏度的荧光标记，所述Vβ基因引物和Cβ基因引物如下： VβoutPCR引物： Vβ1out5′GGAGTCACACAAACCCCAAAGCACCTG3′， Vβ2out5′GTTATCTGTAAGAGTGGAACC3′， Vβ3out5′CTCGTAGATGTGAAAGTAACCCAGAG3′， Vβ4out5′GATAGCCAAGTCACCATGATGTTC3′， Vβ5.1out5′GTCGATTCTCAGGGCGCCAGTTCTC3′， Vβ6out5′GAGTCTCCCAGAACCCCAGACACAAG3′， Vβ7out5′GGTCATGGGAATGACAAATAAGAAG3′， Vβ8out5′CGATAGATGATTCAGGGATGCCCGAG3′， Vβ9out5′GACAAGTCCATTAAATGTGAAC3′， Vβ11out5′CTGACATCTACCAGACCCCAAGATAC3′， Vβ12out5′GATACTGACAAAGGAGAAGTC3′， Vβ13out5′CAAGACCCAGGCATGGGGCTGAAG3′， Vβ14out5′GGGAGATGTTCCTGAAGGGTAC3′， Vβ15out5′CTCGACAGGCACAGGCTAAATTC3′， Vβ16out5′GATTCTTAGCTGAAAGGACTGGAGG3′， Vβ17out5′GAAGGGTACAGCGTCTCTCGGGAGAAG3′， Vβ18out5′GCCGGCGTCATGCAGAACCCAAGAC3′， Vβ20out5′CTCTCAGCCTCCAGACCCCAG3′， Vβ21out5′GCCTGTGGCTTTTTGGTGCAATC3′， Vβ22out5′CACACAGATGGGACAGGAAG3′， Vβ23out5′CCCTGATCGATTCTCAGCTCAAC3′， Vβ24out5′CGGCCGAACACTTCTTTCTG3′； VβinPCR引物： Vβ1in5′CTAAACCTGAGCTCTCTGG3′， Vβ2in5′GCAGCTTCTACATCTGCAG3′， Vβ3in5′GATTCTGGAGTCCGCCAG3′， Vβ4in5′CAGCAGCATATATCTCTGC3′， Vβ5.1in5′GACTCGGCCCTTTATCTTTG3′， Vβ6in5′GGAGATCCAGCGCACAGAG3′， Vβ7in5′CCTGAATGCCCCAACAGCTC3′， Vβ8in5′CCAGCCCTCAGAACCCAGG3′， Vβ9in5′CTGGAGCTTGGTGACTCTGTG3′， Vβ11in5′CCTGGAGTCTGCCAGGCC3′， Vβ12in5′CTCACTCTGGAGTCGCTAC3′， Vβ13in5′GAGGATTTCCCGCTCAGGC3′， Vβ14in5′GAGAAGAGGAATTTCAATTTCC3′， Vβ15in5′GAGTCTGCCATCCCCAAC3′， Vβ16in5′CAGAACTGGAGGATTCTGG3′， Vβ17in5′CGGCCCAAAAGAACCCGACAGC3′， Vβ18in5′GTGCGAGGAGATTCGGCAG3′， Vβ20in5′CAGGACCGGCAGTTCATCTTC3′， Vβ21in5′CCTGCAGAGCTTGGGGAC3′， Vβ22in5′CACTCTGAAGATCCGGTCC3′， Vβ23in5′GAGCTCCTTGGAGCTGGGG3′， Vβ24in5′CATCCGCTCACCAGGCCTGGG3′； Cβout5′CAGGCCTCGGCGCTGACGATCTGGGTGAC3′， 3′Cβin*5′GTTTCTTGATCTCTGCTTCTGATGGCTCAAAC3′， *6-FAMlabelling； d.将设计的引物和由mRNA合成的cDNA通过两次PCR反应来扩增cDNA，所述两次PCR反应的条件为： 第一次反应：变性95℃，45秒；复性60℃，45秒；延伸72℃，45秒，34个循环，72℃10分钟；反应体系为： 5′引物10pmol1μl， 3′引物10pmol1μl， dNTPs10mM1μl， 10×反应缓冲液2.5μl， 三蒸水18.75μl， cDNA0.5μl， TaqDNA聚合酶0.25μl； 第二次反应：变性95℃，30秒；复性60℃，30秒；延伸72℃，30秒，15个循环，72℃10分钟；反应体系为： 5′引物10pmol0.5μl， 3′引物10pmol0.5μl， dNTPs10mM1μl， 10×反应缓冲液2.5μl， 三蒸水19.75μl， 第一次PCR产物0.5μl， TaqDNA聚合酶0.25μl； 其中10×反应缓冲液的组分如下： Tris-HClpH8.3300mM， MgCl250mM， KCl25mM， 明胶0.01％； e.将经过两次PCR反应扩增并被荧光标记的T细胞受体基因，与甲酰胺混合后94℃变性，将变性产物置于含6％丙烯酰胺的测序凝胶中，在DNA测序机上运行，得到的数据用ABIPRISMGeneScan分析软件进行分析和量化，通过比较HIV病毒感染者治疗前后CDR3基因图谱的变化，得出药物疗效的评价结果。
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摘要
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发明提供一种通过设计的特定引物来完成PCR反应，放大感染HIV病毒的患者的T细胞受体TCR基因在接受药物治疗前后的变化，进而评价药物的疗效的方法，本发明提供的技术不但填补了技术上的空白而且具有灵敏度高，准确性好的优点。
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国际公布
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