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您现在的位置: 医学全在线 >> 药学理论 >> 中国药品专利文献 >> 正文:分泌人干扰素-α2a的重组卡介苗及其构建方法专利检索:专利号/专利人/发明人
    

分泌人干扰素-α2a的重组卡介苗及其构建方法

公开(公告)号 CN100335628C  
公开(公告)日 2007.09.05  
申请(专利)号 CN200510025775.5  
申请日期 2005.05.12  
专利名称 分泌人干扰素-α2a的重组卡介苗及其构建方法  
主分类号 C12N15/09(2006.01)I  
分类号 C12N15/09(2006.01)I;C12N15/21(2006.01)I;C12N15/87(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;C07H21/00(2006.01)I;A61K38/21(2006.01)I;A61K39/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I  
分案原申请号  
优先权  
申请(专利权)人 上海交通大学  
发明(设计)人 刘海涛;夏术阶;孙晓文  
地址 200240上海市闵行区东川路800号  
颁证日  
国际申请  
进入国家日期  
专利代理机构 上海交达专利事务所  
代理人 毛翠莹  
国省代码 上海;31  
主权项 一种分泌人干扰素-α2a的重组卡介苗的构建方法,其特征在于包括如下步骤:1)卡介苗穿梭表达载体的构建:分别设计编码Ag85B信号肽的基因片段和IFN-α2a的扩增引物,编码Ag85B信号肽的基因片段的上下游酶切位点分别为BamHI和EcoRI,IFN-α2a的上下游酶切位点分别为EcoRI和SalI,经聚合酶链式反应分别合成编码Ag85B信号肽的基因片段和IFN-α2a基因片段,将编码Ag85B信号肽的基因片段克隆到pMV261载体中,得到pMS,再将IFN-α2a基因片段与pMS载体编码Ag85B信号肽的基因片段连接,得到穿梭表达载体pMSIFN-α2a;2)卡介苗的培养:选取卡介苗为上海丹麦株,将卡介苗放在含有液体培养基的烧瓶中进行摇床培养,液体培养基含有10%的营养剂ADC、0.5%吐温80和0.2%甘油,摇床培养100转/分,三周后卡介苗处于对数生长期,OD600值=0.6,制得感受态卡介苗;3)电转化技术构建重组卡介苗rBCGIFN-α2a:在一离心管中混匀400μl含1×108cfu的感受态卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表达载体pMSIFN-α2a,置于基因脉冲仪中进行电转化得到阳性重组子,电转参数:电压为2500V,电容为25μF,电阻为1000Ω,阳性重组子先在含有50μg/ml卡那霉素的固体培养基中筛选,培养两周后得到阳性克隆rBCGIFN-α2a,然后接种在含有50μg/ml卡那霉素的液体培养基摇床生长,大量培养;4)重组卡介苗rBCGIFN-α2a的鉴定与功能检测:进行抗酸染色初步确定rBCGIFN-α2a为抗酸杆菌,抽提rBCGIFN-α2a质粒DNA后,PCR扩增得到IFN-α2a的基因片段,WesternBlot检测到rBCGIFN-α2a培养上清中和菌体中有IFN-α2a蛋白的表达,ELISA方法检测到rBCGIFN-α2a培养上清中有高含量的IFN-α2a。  
摘要 本发明涉及一种分泌人干扰素-α2a的重组卡介苗及其构建方法,利用基因工程技术将起分泌作用的卡介苗Ag85B信号肽片段和人IFN-α2a的基因克隆至pMV261,得到卡介苗穿梭表达载体pMSIFN-α2a,然后采用电穿孔技术将pMSIFN-α2a导入BCG构建重组卡介苗rBCGIFN-α2a,依靠pMSIFN-α2a在BCG的复制和信号肽的分泌作用,能够高效分泌IFN-α2a。本发明得到的重组卡介苗rBCGIFN-α2a具有BCG和IFN-α2a的双重效果,能够有效预防和治疗浅表性膀胱肿瘤;利用重组卡介苗rBCGIFN-α2a在膀胱腔内的局部协同作用减少BCG和外用IFN-α2a的用量,可以克服BCG治疗的毒副作用。  
国际公布  
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