公开(公告)号
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CN1320113C
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公开(公告)日
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2007.06.06
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申请(专利)号
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CN03129043.4
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申请日期
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2003.06.05
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专利名称
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一种利用大肠杆菌发酵制备小干扰RNA分子的方法
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主分类号
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C12N15/10(2006.01)I
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分类号
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C12N15/10(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I
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分案原申请号
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优先权
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申请(专利权)人
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复旦大学;上海复旦新杨生物科技有限责任公司;上海恒达科技发展股份有限公司
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发明(设计)人
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钱志康;宣宝琴;李 琳;徐剑锋;谭 畅;闵太善;王维荣;谢承光;沈水源;程小伟;史顺成;黄伟达
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地址
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200433上海市邯郸路220号
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颁证日
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国际申请
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进入国家日期
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专利代理机构
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上海正旦专利代理有限公司
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代理人
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陆 飞
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国省代码
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上海;31
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主权项
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一种制备RNAi用siRNA分子的方法,其特征在于包括构建长链dsRNA表达载体,并转化大肠杆菌宿主菌,通过工业化规模发酵,用碱-SDS法抽提发酵菌体得到全RNA和质粒DNA的混合物;该混合物用CF-11柱进行纯化得到dsRNA;最后利用大肠杆菌RNase III将长链的dsRNA切成12-30bp的小干扰RNA;其中,构建在大肠杆菌中表达长链dsRNA的表达载体的方法如下:(1)将目的基因片段以相反的方向将基因的3’端连接到第三段DNA片段的两侧,然后克隆到带有一个T7启动子的载体中去;当把此表达质粒转化到能表达T7 RNA聚合酶的宿主菌内后,目的基因的正反两个方向的DNA链以及两者之间的第三段DNA链就能被依次转录,成为一条连续的RNA链;或者(2)利用带有大肠杆菌复制起点的表达载体,在合适的位置加入抗性基因和多克隆位点,并在多克隆位点两侧分别加入方向相对的两个启动子以及终止子,在多克隆位点中插入目的DNA片段后以正反两个方向转录RNA。
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摘要
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本发明涉及一种利用大肠杆菌发酵大规模制备RNA干扰用小干扰RNA分子的新方法。本发明构建了长双链RNA表达载体,并转化大肠杆菌宿主菌,通过大规模发酵,用碱-SDS法抽提发酵菌体得到全RNA和质粒DNA的混合物。该混合物用CF-11柱进行纯化得到长双链RNA。最后利用大肠杆菌Ⅲ型RNA酶将长双链RNA切成12-30bp的小干扰RNA。得到的siRNA用分光光度法检测其纯度与浓度,OD260/OD280=1.978,表明样品的纯度相当高。每100g大肠杆菌菌体得到siRNA样品约为210mg。
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国际公布
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