| 公开(公告)号 | CN1314802C |
| 公开(公告)日 | 2007.05.09 |
| 申请(专利)号 | CN200410075772.8 |
| 申请日期 | 2004.12.30 |
| 专利名称 | 利用体细胞杂交技术将藏药材药效成分转入受体细胞的方法 |
| 主分类号 | C12N15/05(2006.01)I |
| 分类号 | C12N15/05(2006.01)I;C12N5/14(2006.01)I;A01H4/00(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 山东大学 |
| 发明(设计)人 | 向凤宁;夏光敏;蔡云飞;李子东;江 莉 |
| 地址 | 250100山东省济南市历下区山大南路27号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 济南圣达专利商标事务所 |
| 代理人 | 郑华清 |
| 国省代码 | 山东;37 |
| 主权项 | 一种利用体细胞杂交技术将藏药材药效成分转入受体细胞的方法，其特征在于，步骤如下：1)双亲材料来源：受体和供体材料的选择及其胚性愈伤组织和悬浮系的诱导和筛选，获得培养细胞；受体材料为柴胡、胡萝卜或马铃薯，供体材料为川西獐牙菜、四数獐牙菜、管花秦艽、白花假龙胆或湿生扁蕾，取供体材料的幼叶及未成熟种子在MS诱导培养基上诱导愈伤组织，愈伤组织在继代培养基上继代后，选取胚性愈伤组织作为供体，用胚性愈伤组织建立的胚性悬浮系作为受体；2)受、供体原生质体的游离：将受体和供体培养细胞放入酶液中，于25℃下游离3～4小时温育后，用300～400目不锈钢网过滤，500r/min离心收集原生质体；3)UV处理供体原生质体：将收集的供体原生质体用洗液洗一次后，调成1×106/mL的密度，铺在直径3.5cm的玻璃培养皿中成薄层后用UV照射；紫外线照射强度为380μW/cm2/1.0-2.0min；4)双亲原生质体的融合与培养：将供体与受体按1∶1的体积比混合均匀，用PEG法诱导融合；融合流程如下：(1)原生质体滴加在直径3.5cm的培养皿中，铺成一薄层，静置15分钟～20分钟；(2)沿薄层边缘滴加PEG溶液，静置15～20分钟；(3)再加二倍体积的0.225M～0.275M Ca(NO3)2液，静置10分钟～15分钟，重复一次；(4)吸掉培养皿中液体，洗液洗两次，每次5分钟～10分钟；(5)用P5液体培养基洗一次；(6)用Parafilm封口，25℃避光保湿培养；再生愈伤组织长至1.5mm～2mm时挑出，转至MS培养基中继代培养，每天光照12h，光强2000Lux，温度25℃；5)杂种愈伤组织及植株再生：把长至1.5mm～2mm的融合再生克隆先挑出，在MS固体培养基中培养，获得杂种愈伤组织和再生植株；6)藏药材体细胞杂种目标性状的筛选：筛选繁殖系数高的杂种细胞系，并利用高压液相色谱测定各种杂种细胞系的有效成分含量，比较分析杂种间差异，获得生长快速、药效成分含量高的杂种细胞系及其植株；其中，酶液成分：15mg/ml Cellulase Onozuka RS，3mg/ml Pectolyase Y-23，5mM MES，0.6M甘露醇，5mM CaCl2，pH 5.8；洗液成分：0.6M甘露醇，5mM CaCl2，pH 5.8；PEG溶液的配方：2g葡萄糖，1.5g Ca(NO3)2，40g分子量6000的PEG，溶解在100ml无离子水中，调pH至7.0，抽滤灭菌；Ca(NO3)2溶液的配方：9g无水Ca(NO3)2+200ml无离子水，调pH至7.0，抽滤灭菌；P5培养基：MS培养基的大量元素+MS培养基的微量元素+B5维生素+500mg/L水解酪蛋白+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+90g/L葡萄糖+975mg/L MES，pH5.6--5.8：MS培养基：MS培养基的大量元素+MS培养基的微量元素+MS维生素+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+30mg/L水解酪蛋白+30mg/L+7g/l蔗糖琼脂粉，pH5.8--6.0：MS诱导培养基：MS培养基+2mg/L 2，4-D；MS继代培养基：MS培养基+2mg/L 2，4-D+0.5mg/L激动素；MS1培养基：MS培养基+1mg/L 2，4-D。 |
| 摘要 | 本发明公开一种利用体细胞杂交技术将藏药材药效成分转入受体细胞的方法，主要步骤包括：1)双亲材料来源；2)受体、供体原生质体的游离；3)UV处理供体原生质体；4)双亲原生质体的融合与培养；5)杂种愈伤组织及植株再生；6)生长快速、药效成分含量高的藏药材体细胞杂种细胞系及其植株的获得。本发明是利用体细胞杂交技术获得药效成分含量高、生长快速的细胞系，其优势在于：可为资源匮乏、难以培养的名贵藏药材有效成分生产提供直接而简便的方法，获得的药效成分含量高、生长快速、遗传稳定的杂种细胞系可用于藏药材药效成分的工业化生产，将在藏药材资源有效利用上发挥重要作用，产生巨大的经济效益。 |
| 国际公布 |
