公开(公告)号
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CN1311074C
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公开(公告)日
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2007.04.18
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申请(专利)号
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CN200410098027.5
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申请日期
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2004.12.03
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专利名称
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重组表达的羧肽酶B及其纯化
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主分类号
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C12N9/00(2006.01)I
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分类号
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C12N9/00(2006.01)I;C12N9/48(2006.01)I;C12N15/52(2006.01)I;C12N15/57(2006.01)I;C12N15/63(2006.01)I;C12N11/00(2006.01)I;C12N15/81(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I
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分案原申请号
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优先权
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2003.12.5 EP 03028101.8
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申请(专利权)人
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霍夫曼—拉罗奇有限公司
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发明(设计)人
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S·格拉瑟;F·盖佩尔;T·柯施鲍姆;B·雷克塞尔;J·-P·塔尔霍菲;R·米勒;C·吉塞尔;H·埃克施泰因;E·沃尔夫
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地址
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瑞士巴塞尔
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颁证日
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国际申请
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进入国家日期
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专利代理机构
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中国专利代理(香港)有限公司
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代理人
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张轶东;刘 玥
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国省代码
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瑞士;CH
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主权项
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一种生产具有羧肽酶B活性的蛋白的方法,包括如下步骤:a)提供一种含有编码由N-末端与组氨酸标记融合的大鼠前羧肽酶B和信号肽构成的前体蛋白的核苷酸序列的载体,由此在组氨酸标记和信号肽之间或在组氨酸标记和大鼠羧肽酶B之间任选地插入一种间隔序列;(b)采用该载体转化一种微生物宿主有机体;(c)在含有营养物和碳源的生长培养基中培养该微生物宿主有机体,其中微生物宿主有机体表达前体蛋白并将组氨酸标记的前羧肽酶B分泌至生长培养基中;(d)把步骤(c)的生长培养基中的分泌的组氨酸标记的前羧肽酶B固定在能结合组氨酸标记的颗粒状的金属螯合物亲和基质上,并冲洗颗粒状的金属螯合物亲和基质,从而将组氨酸标记的前羧肽酶B固定;(e)在一种含有胰蛋白酶的缓冲液中温育步骤(d)中的带有固定化的组氨酸标记的前羧肽酶B的颗粒状的金属螯合物亲和基质,由此通过蛋白水解方式酶切前羧肽酶B部分并将具有羧肽酶B活性的蛋白释放到液相中,由此组氨酸标记的前肽部分被固定;(f)从颗粒状的金属螯合物基质中分离含有具有羧肽酶B活性的蛋白的液相,由此组氨酸标记的前肽部分被固定;和(g)从步骤(f)的液相中纯化具有羧肽酶B活性的蛋白。
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摘要
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本发明提供了一种生产来源于非动物宿主有机体的,具有来自前羧肽酶B酶原的羧肽酶B活性的蛋白的制备方法。在非变性条件下,由酶原活化得到羧肽酶B。尤其是,该活化是在避免前肽与活化的羧肽酶B酶的不必要的非共价结合的条件下进行的。
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国际公布
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